【正文】 酸合成缺陷型酵母。 正常的高甘露糖寡糖鏈上僅有 813個(gè)甘露糖。 ③ 重組蛋白常常超糖基化 ① 表達(dá)量普遍低。 ⑥ 安全性高（ FDA確認(rèn)的安全生物），不 需要宿主的安全性檢驗(yàn)。 ④有 翻譯后的加工。 ② 小量培養(yǎng)和大規(guī)模反應(yīng)器中都能生長(zhǎng)。 ③ 比 YRp穩(wěn)定。含有自主復(fù)制起始區(qū) ori和 STB序列（使質(zhì)粒在供體中維持穩(wěn)定）。 由大腸桿菌質(zhì)粒、 2?m質(zhì)粒 及酵母染色體 DNA選擇標(biāo)記構(gòu)成。 ① 行為像染色體，能穩(wěn)定遺傳。 ③ 穿梭載體（ shuttle vector） 在 YRp質(zhì)粒中插入酵母染色體的 著絲粒區(qū) 。 ② 可從大腸桿菌和酵母中提取質(zhì)粒。 大腸桿菌質(zhì)粒 酵母 ARS （ 2）復(fù)制型載體 (YRp) 酵母選擇標(biāo)記 ARS ARS（ automously replicating sequence） : ATTTTATATTTA T G T 250bp 保守區(qū) 特點(diǎn)： ① 轉(zhuǎn)化率高（ 102103轉(zhuǎn)化子 /微克 DNA) 。 ② 不能在酵母細(xì)胞中自主復(fù)制 ③ 整合到酵母的染色體上 ④ 不能從酵母細(xì)胞中提取載體。 特點(diǎn)： 載體上只有細(xì)菌的復(fù)制區(qū)，沒(méi)有酵母的自主復(fù)制區(qū)。 Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells 由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的 DNA片斷（選擇標(biāo)記）構(gòu)成。 ④ 有合適的克隆位點(diǎn)。 第二節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá) 真核或病毒啟動(dòng)子 MCS PolyA信號(hào) 終止子 外源基因 ① 能在 。 （如糖基化、氨基酸修飾等）。 2. 前體切割 （ 1） O糖基化（ Ser, Thr） 增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和某些特殊性質(zhì)。 八、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾 分子內(nèi)二硫鍵、分子間二硫鍵，二硫鍵異構(gòu)酶催化，使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。 （ 3）表達(dá)分泌蛋白 細(xì)胞質(zhì) 外膜 內(nèi)膜 周間質(zhì) 質(zhì)粒 染色體 “外排 ” ： 蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過(guò)內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中?？砂?pin增加到載體上。 ② 大腸桿菌的 htp R基因突變也減少蛋白酶的降解作用。 質(zhì)?；虍a(chǎn)物 目的基因產(chǎn)物 N C 切割 6. 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 防止被宿主的蛋白水解酶降解。 N末端：由原核基因編碼一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。 當(dāng)宿主大量 生長(zhǎng)后 ，再誘導(dǎo)載體制粒的復(fù)制，增加拷貝數(shù)。宿主生長(zhǎng)受抑制。宿主大量生長(zhǎng)。 cI857 PL 外源基因 PO ?PL啟動(dòng)子是溫度誘導(dǎo)型 調(diào)節(jié)基因 lac I（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物。 C: 42176。 cI857阻遏物有活性，抑制 ?PL啟動(dòng)子，外源基因不表達(dá)，宿主大量生長(zhǎng)。 將宿主生長(zhǎng)代謝與外源基因表達(dá)分開。 4. 增加 mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性 在外源基因的下游插入 “ 重復(fù)性基因外回文序列 ” 能防止 mRNA受到 3’?5’外切酶的攻擊。 3. 改變起始密碼下面的幾組密碼子 一般為 59bp。 1. 選擇強(qiáng)啟動(dòng)子序列，如 tac 等 七、提高表達(dá)水平常用的方法 2. 調(diào)整 SD序列與 AUG堿的距離 距離過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都影響真核基因的表達(dá)。增加表達(dá)效率。 la c P S D la c A TG croA TG croA TG croA TG croA TG croA TG croA TG croA TG croA TG cropTR 213pTR 199pTR 214pTR 188pTR 194pTR 210pTR 182pTR 190BamH ICro 的表達(dá)水平S D 距 A TG 的距離載體3. 啟動(dòng)子與外源基因之間的距離 轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體 不會(huì)轉(zhuǎn)錄非必須基因 ，不必浪費(fèi)源量和能量、不會(huì)干擾正常的表達(dá)。 2. 轉(zhuǎn)譯起始序列對(duì)表達(dá)效率的影響 （ 1） SD序列 ？？？？ （ 2）起始密碼 AUG AUG左側(cè)的三個(gè)堿基也有影響。 （ 3） 35區(qū)和 10區(qū)的堿基順序 越接近一致順序，啟動(dòng)子越強(qiáng)。而咪唑與 Ni離子的親和力大于組氨酸，用含咪唑的洗脫液洗脫就可將凝膠上的泛素融合蛋白交換下來(lái)，這就是 Ni瓊脂糖親和層析柱的作用原理。組氨酸能與多種過(guò)渡金屬離子 Cu2+、 Zn2+、 Ni2+、 Co2+、 Fe3+發(fā)生特殊的相互作用，且與 Ni2+具高度親和力，利用這個(gè)原理可以把富含這類氨基酸的蛋白質(zhì)吸附，從而達(dá)到分離的目的。 （ 3）產(chǎn)物提純 （ 4）產(chǎn)物分離 用凝血酶或 Xa因子可以把外源蛋白從GST上切下來(lái)。 ① 啟動(dòng)子： tac ② 操縱基因： lacO ③ 調(diào)節(jié)基因： lacI ④ SD序列 （ 1）優(yōu)點(diǎn) （ 2）組成結(jié)構(gòu) 便于融合蛋白的分離和純化。 ④ 分泌信號(hào)肽： 大腸桿菌外膜蛋白基因 ompa ⑤ 插入位點(diǎn)區(qū)（多克隆位點(diǎn)） ① 強(qiáng)啟動(dòng)子： （ 1）組成結(jié)構(gòu) pIN III系列： pIN IIIA1 以 pBR322為基礎(chǔ)構(gòu)建的。 Ipp lac P lac O SD/ATG ompa 插入位點(diǎn) Ipp（脂蛋白基因啟動(dòng)子）和 lacUV5啟動(dòng)子。 ② 蛋白質(zhì)內(nèi)有與分泌相關(guān)的 aa 序列。 真核細(xì)胞中的分泌蛋白能在大腸桿菌中很好地分泌表達(dá)； 但非分泌蛋白很難在大腸桿菌中分泌。 堿性氨基酸 N 疏水氨基酸核心區(qū) 切割位點(diǎn) Arg、 Lys Leu、 Ile AlaGlySer 信號(hào)肽酶 外源蛋白 ① 有信號(hào)肽。 如： pIN III系列： pIN IIIA1, pIN IIIA2, pIN IIIA3, 2. 分泌型表達(dá)載體 細(xì)菌蛋白分泌的條件： 位于 N端，一般為 1530aa 。 ⑦ 表達(dá)誘導(dǎo)物： IPTG（乳糖的類似物，不會(huì)被降解） 阻遏物 IPTG 必須選擇一個(gè)有l(wèi)acI的宿主菌。 如 JM105菌。 pKK2233 載體 組成結(jié)構(gòu)： ① 強(qiáng)啟動(dòng)子 : tac（ trplac） : trp的 35區(qū) lacUV5的 10區(qū) lac操縱基因 ② 操縱基因： 乳糖操縱子系統(tǒng)。 缺點(diǎn)： 容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。 3. 胞外表達(dá) 載體表達(dá)出的外源基因蛋白質(zhì)不與細(xì)菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。 用溶血素（ hemolysin）基因構(gòu)建分泌性融合蛋白； 使在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白 分泌到細(xì)胞外 的培養(yǎng)基中。 ③ 枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶 （ endoglucanase）。 （ 4） 真核信號(hào)肽 ④ 胡蘿卜歐氏桿菌的 PelB蛋白。 鼠源 RNase、人生長(zhǎng)激素信號(hào)肽。但以后需要正確切割掉。 蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)的復(fù)雜機(jī)理目前不完全清楚 優(yōu)點(diǎn)： 容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。 有正確的氨基酸序列，但空間構(gòu)象是錯(cuò)誤的，回收的蛋白生物活性差。 1. 細(xì)胞質(zhì)中表達(dá) 在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人生長(zhǎng)激素（ human growth hormone, hGH）。 OL 四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位 包涵體（ inclusion body） 是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種 不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物 , 主要由外源蛋白組成。 整合在宿主基因組里，或克隆到載體上。進(jìn)入溶原期。 R:右； L:左 cIII N PL/OL cI PM OR/PR Cro PE cII 阻遏物 轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄 當(dāng) cI合成后，與 OL和 OR結(jié)合阻止 RNA聚合酶，則左右基因都受到抑制。 （ 4） PL和 PR啟動(dòng)子 是從 ?噬菌體中得到的一類啟動(dòng)子，比 lac啟動(dòng)子的活性高 810倍，比 trp啟動(dòng)子活性高。 trpR P1 O ? trpE trpD P2 trpC trpB trpA 阻遏物 色氨酸 結(jié)合 不轉(zhuǎn)錄 用于表達(dá)載體的 trp啟動(dòng)子一般只包含啟動(dòng)基因、操縱基因、和部分 trpE基因。 L L 前導(dǎo)區(qū) 色氨酸操縱子 trpR P1 O ? trpE trpD P2 trpC trpB trpA 鄰氨基苯甲 酸合成酶 吲哚甘油 硼酸合成酶 色氨酸 合成酶 ?鏈 ?鏈 分支酸 鄰氨基 苯甲酸 磷酸核糖基 鄰氨基苯甲酸 CDRP 吲哚甘 油 磷酸 色氨酸 阻遏物 轉(zhuǎn)錄 （ P1是主要啟動(dòng)子， P2的作用只有 3%。 Plac O 目的基因 （ 2） 乳糖啟動(dòng)子 lac 阻遏物與操縱基因結(jié)合