【正文】 124+pSC101+ColE1=pBR322質(zhì)粒載體 ? 優(yōu)點(diǎn) ① 具有較小的分子量 ， 容易純化 ② 具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào) ③ 具較高的拷貝數(shù) ④ 對(duì)多種常見的限制性內(nèi)切核酸酶只含有一個(gè)能切割的位點(diǎn) 第二節(jié) 大腸桿菌質(zhì)粒載體 二、 pUC質(zhì)粒載體 ※ 1987年， MCS技術(shù)在 pBR322和 M13基礎(chǔ)上構(gòu)建的 ? 優(yōu)點(diǎn) ① 具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù) ② 適用于組織化學(xué)法檢測(cè)重組體 ③ 具有多克隆位點(diǎn)區(qū)段 （ MCS） 第二節(jié) 大腸桿菌質(zhì)粒載體 三、 pGEM系列載體 ※ 由 pUC派生而來(lái) ※ 與 pUC的主要區(qū)別是在 MCS的兩側(cè)分別加了一個(gè)噬菌體啟動(dòng)子 T7和SP6 ? 特點(diǎn) ① 如果加入純化的 T7或 SP6 RNA聚合酶 ，在試管里就可以轉(zhuǎn)錄 mRNA ② 外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄 ③ MCS與 pUC18的完全一樣 第三節(jié) 病毒（噬菌體）載體 ※ 病毒基本結(jié)構(gòu)： DNA（或 RNA） + 外殼蛋白 感染細(xì)菌的病毒，稱為噬菌體。 第三節(jié) 病毒（噬菌體）載體 ※ 分類 （根據(jù)病毒與宿主關(guān)系）： 溫和性病毒： 溶原性增殖 → 構(gòu)建病毒載體 烈性病毒： 溶菌性增殖 → 改造后構(gòu)建病毒載體 ※ 噬菌體的生命周期分為 溶菌周期 和溶源周期 ，只具有溶菌生長(zhǎng)周期的噬菌體顆粒叫 烈性噬菌體 。 烈性噬菌體溶菌生長(zhǎng)的基本過(guò)程： 吸附 吸附到位于感染細(xì)胞表面的特殊接受器上 注入 噬菌體 DNA穿過(guò)細(xì)胞壁注入寄主細(xì)胞 轉(zhuǎn)變 被感染的細(xì)胞成為制造噬菌體顆粒的場(chǎng)所 合成 大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質(zhì) 組裝 包裝了 DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒 釋放 合成的子代噬菌體顆粒從寄主細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái) 噬菌體的溶源生命周期： 溶源生長(zhǎng)周期： 是指在感染過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體的 DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體 DNA上，成為它的一個(gè)組成部分。 現(xiàn)知只有雙鏈 DNA的噬菌體才具有溶源周期 λ噬菌體 （一） λ噬菌體性質(zhì) ①組成： λDNA + 外殼蛋白 ? λDNA () ? 噬菌體中：線性 ? 宿主細(xì)胞：環(huán)狀 (cos位點(diǎn) ) λ噬菌體 （一） λ噬菌體性質(zhì) ②是一個(gè)溫和噬菌體 ? 一般以溶源生長(zhǎng)進(jìn)行增殖，脅迫條件下也會(huì)進(jìn)入溶菌生長(zhǎng)周期。 λ噬菌體 （一） λ噬菌體性質(zhì) ③復(fù)制 ? 溶源周期 隨溶源細(xì)菌染色體一起復(fù)制 ? 溶菌周期 的早期是 “ θ‖復(fù)制 ，晚期進(jìn)行 滾環(huán)復(fù)制 λ噬菌體 （一） λ噬菌體性質(zhì) ④基因組成 ? λDNA至少包括 61個(gè)基因，大多基因按功能相似性成簇排列 ? 其中一部分為噬菌體生命活動(dòng)的必須基因，另一部分約 1／ 3為非必須區(qū)段 λ噬菌體 （二） λ噬菌體載體的構(gòu)建依據(jù) λ噬菌體是一種溫和噬菌體 能承載較大的外源 DNA片段 λDNA頭部可包裝約 ～ 51kb（自身的 75%～ 105%），且約有20kb λDNA可缺失（生長(zhǎng)非必需） 在 λDNA上有多種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) λ噬菌體 （三） 構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線 策略： 切去部分非必需區(qū) 刪掉多余的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) 插入選擇性標(biāo)記基因 建立體外包裝系統(tǒng) 。 λ噬菌體 （三） 構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線 技術(shù)路線 ： ① 用限制性酶切去非必需區(qū) ， 抹去多余識(shí)別位點(diǎn) λ噬菌體 （三） 構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線 技術(shù)路線 ： ② 在 λDNA的非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因 最常用的篩選標(biāo)記： Lac Z基因 λ噬菌體 （三） 構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線 技術(shù)路線 ： ③ 建立重組 λDNA分子體外包裝系統(tǒng) D（ D基因缺失噬菌體 ） ＋ E（ E基因缺失噬菌體 ） ＝ λ 噬菌體 λ噬菌體 （四） λ噬菌體載體的類型 ①插入型 （ Insertion vectors） ? 一種只具有一個(gè)可供外源 DNA插入的克隆位點(diǎn)的派生載體。 ? 如： λgt10 、 λgt11 λ噬菌體 （四） λ噬菌體載體的類型 ②置換型 （ Replacement vectors） ? 具有兩個(gè)對(duì)應(yīng)的酶切克隆位點(diǎn)，在兩個(gè)位點(diǎn)之間的 λDNA區(qū)段是 λ噬菌體的非必需序列，可以被外源插入的 DNA取代。 ? 如 Charon 4 載體 （ 凱倫噬菌體載體 ） 常用的 λ噬菌體衍生載體 載體名稱 分子大小 (kb) 可克隆外源 DNA片段大小 (kb) ? Charon 3A 0 – ? Charon 4A 0 – ? Charon 17 0 ? Charon 20 0 – ? Charon 21 A 0 – ? Charon 28 0 – ? Charon 30 0 ? LA 7 –1 0 – ? Sep6lac 5 0 – ? BF 101 46 .0 – M13噬菌體 （一） M13噬菌體性質(zhì) ①絲狀噬菌體，內(nèi)有一環(huán)狀單鏈 DNA分子（“ +‖鏈 DNA） 大小： 結(jié)構(gòu)： 10個(gè)區(qū) 基因間隔區(qū)（ IS區(qū)） 含復(fù)制起始位點(diǎn)及可插入外源 DNA的位點(diǎn) M13噬菌體 ② 復(fù)制與增殖 M13 DNA―+‖鏈進(jìn)入 雄性大腸桿菌 → 合成 “ ‖鏈 → 產(chǎn)生雙鏈 M13 DNA（復(fù)制型 DNA或 RFDNA） → 按環(huán)狀雙鏈 DNA方式復(fù)制，同時(shí)以 “ +‖鏈 DNA為模板轉(zhuǎn)錄包裝蛋白 → RFDNA達(dá) 200拷貝時(shí)，單鏈 DNA特異結(jié)合蛋白與“ +‖鏈結(jié)合而阻斷合成 “ ‖鏈 → 結(jié)果只能以 “ ‖鏈為模板合成 “ +‖鏈 → “ +‖鏈 DNA被包裝蛋白包裝成新的 M13噬菌體 → 擠出受體細(xì)胞 → 宿主細(xì)胞不被溶菌。 RF DNA M13噬菌體 （二） M13噬菌體性質(zhì) ①在 IS區(qū)內(nèi)插入 LacZ基因 ②在標(biāo)記基因區(qū)內(nèi)組裝 MCS區(qū)段 柯斯質(zhì)粒 ※ 柯斯質(zhì)粒載體，又稱粘粒、柯斯載體 ，是一類人工構(gòu)建的含有 λDNA的cos序列 和 質(zhì)粒復(fù)制子 的特殊類型的質(zhì)粒載體， cosmid是 cos site carrying plasmid的縮寫。 ? 柯斯質(zhì)粒pHC79 系由質(zhì)粒pBR322和噬菌體 λ的cos位點(diǎn)的一段 DNA構(gòu)成全長(zhǎng) Cosmid載體的特點(diǎn) ①具有 λ噬菌體的特性 ②具有質(zhì)粒載體的特性 ③高容量的克隆能力 采用柯斯質(zhì)粒作載體的不足 ① 載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的1/10左右，因此往往會(huì)出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個(gè)重組分子內(nèi)可有幾個(gè)柯斯質(zhì)粒載體連在一起。 采用柯斯質(zhì)粒作載體的不足 ② 大小不等的外源片段相互連接后插入同一個(gè)載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來(lái)不是相鄰的片段錯(cuò)亂地連接成一個(gè)片段，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析 采用柯斯質(zhì)粒作載體的不足 ③ 細(xì)菌的菌落體積遠(yuǎn)大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫(kù)，則篩選所需的含某一 DNA片段的菌落很費(fèi)時(shí)間。 第四節(jié) 人工染色體克隆載體 ※ 人工染色體 指人工構(gòu)建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統(tǒng)。 溫和性病毒： 溶原性增殖 → 構(gòu)建病毒載體 烈性病毒： 溶菌性增殖 → 改造后構(gòu)建病毒載體 酵母人工染色體（ YAC） ? 酵母人工染色體（ YAC)是人工染色體中能 克隆最大 DNA片段的載體 ，可以插入1002022kb的外源 DNA片段。 ? 有酵母的自主復(fù)制序列、著絲點(diǎn)、四膜蟲的端粒以及酵母選擇性標(biāo)記組成的酵母線性克隆載體。 pYAC4人工染色體 ? 優(yōu)點(diǎn)： 可以容納更長(zhǎng)的 DNA片段，用較少的克隆就可以包含特定的基因組全部序列，從而保持了基因組特定序列的完整性，有利于物理圖譜的制作。 例如，某些基因如人凝血因子 VII基因長(zhǎng)達(dá)180kb，肌營(yíng)養(yǎng)不良基因大于 1800 kb． ? 缺點(diǎn)： （ 1）克隆外源基因易出現(xiàn)嵌合體 （ 2）有些克隆不穩(wěn)定 （ 3） YAC克隆不容易與酵母自身染色體相分離 細(xì)菌人工染色體（ BAC） ? 細(xì)菌人工染色體（ BAC）是以細(xì)菌 F因子為基礎(chǔ)構(gòu)建的細(xì)菌克隆載體。 ? BAC克隆容量可以達(dá) 300kb ，可以通過(guò)電穿孔導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞。 ? 拷貝數(shù)低，穩(wěn)定，比 YAC易分離。 P1派生人工染色體（ PAC） ? P1派生人工染色體（ PAC）是將BAC和 P1噬菌體載體 二者優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)的克隆體系，可以克隆 100300kb的外源 DNA片段。 ? 含有卡那霉素抗性基因，便于篩選。 ? 在宿主細(xì)胞中以單拷貝的形式存在，避免了因多拷貝造成的不穩(wěn)定。 哺乳動(dòng)物人工染色體（ MAC） ? 哺乳動(dòng)物人工染色體（ MAC）指從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離出復(fù)制起始區(qū)、端粒以及著絲粒構(gòu)建而成的克隆載體。 ? 可以克隆大于 1000kb的外源 DNA片段。 人類游離人工染色體（ HAEC） ? 基于人類 EB病毒（人類皰疹病毒）而構(gòu)建的環(huán)形 DNA，含有 EB病毒 的復(fù)制原點(diǎn)（ oriP）和 潮霉素 （鏈霉菌產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素）抗性基因。 ? 能以環(huán)形小染色體形式復(fù)制，并在有絲分裂中保持穩(wěn)定。