【正文】 可采用谷胱甘肽 sepharose親和柱進(jìn)行純化，帶 組氨酸標(biāo)簽 的融合蛋白采用 金屬螯合層析 純化）。 4. 蛋白降解 “ N末端規(guī)則 ” ： Ｎ末端 Arg、 Lys、 Leu、 Phe、 Tyr和 Trp的半衰期為２分鐘，除脯氨酸外的其他氨基酸的半衰期均超過 10小時(shí) 。 在 mRNA： ? mRNA的 5‘ UTR的序列； ? 339。 SD序列和 SD與起始密碼子間的距離影響翻譯起始的效率： ? 在間隔相同的情況下，不同 SD序列翻譯效率不同。 比其他的真核表達(dá)體系培養(yǎng)成本低，只需要含鹽的簡單培養(yǎng)基； 適于高密度培養(yǎng)，菌體干重可達(dá) 100g/L以上。 四、化學(xué)合成 已知基因或蛋白質(zhì)全長序列，合成短的寡核苷酸片斷，拼接為長的 DNA片斷，再用連接酶連接成完整基因。 革蘭氏陰性菌 優(yōu)勢： 遺傳背景清楚，基因組序列已確定； 生長迅速，平均 20~30min繁殖一代； 易于培養(yǎng)，生產(chǎn)成本低，適合大規(guī)模培養(yǎng)； 外源基因表達(dá)水平高，可達(dá)總蛋白的 5~30％以上； 有大量可供選擇利用的克隆和高效表達(dá)載體。 （ 4）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 以中國倉鼠卵巢細(xì)胞（ CHO） 和非洲綠猴腎細(xì)胞（ COS） 細(xì)胞使用最多。端，使其 A、 T含量增加，減少 mRNA二級結(jié)構(gòu)增加翻譯效率。 對策： （ 1）常用密碼子替換稀有密碼子； （ 2）與 “ 稀有 ” tRNA基因共表達(dá)。 缺點(diǎn)： 對融合蛋白進(jìn)行位點(diǎn)特異性裂解。 (3) 胞外表達(dá) 胞外表達(dá)優(yōu)點(diǎn)： ? 可簡化蛋白質(zhì)的純化； ? 減少蛋白酶對目的蛋白質(zhì)的降解 然而目前還未完全闡明大腸桿菌外分泌的機(jī)理，迄今為止還未設(shè)計(jì)出切實(shí)可行的在胞外制備大量外源蛋白的方案。 1. 有效的表達(dá)載體 (6) mRNA的穩(wěn)定性 mRNA的快速降解會影響蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，提高mRNA穩(wěn)定性有利于提高外源基因的表達(dá)。端互補(bǔ)結(jié)合。 畢赤酵母的特點(diǎn)： 為真核表達(dá)體系，可進(jìn)行翻譯后修飾； 表達(dá)量高，明膠的表達(dá)量可達(dá) 。 原核：以基因組為模板 反轉(zhuǎn)錄 PCR（ RTPCR）： 提取 mRNA， 反轉(zhuǎn)錄生成cDNA作為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增獲得目的基因。 缺點(diǎn)： ? 缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng)，缺少糖基化功能 ； ? 沒有有效釋放蛋白到培養(yǎng)基中的分泌機(jī)制 ； ? 表達(dá)的外源蛋白多形成包涵體，蛋白的復(fù)性較困難 ； ? 翻譯目的蛋白 N端常多一個(gè)甲硫氨酸殘基（ AUG編碼）。 優(yōu)點(diǎn)： 糖基化的基因產(chǎn)物接近或類似于天然產(chǎn)物，可分泌表達(dá)。 1. 有效的表達(dá)載體 (4) 終止密碼子 在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，通常插入三個(gè)終止密碼子以防止核糖體的跳躍。 不常用密碼子 氨基酸 AGA,AGG,CGA,CGG Arg UGU,UGC Cys AUA Ile CUA,CUC Leu CCC,CCU,CCA Pro UCA,AGU,UCG,UCC Ser ACA Thr 3. 外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位 (1) 胞內(nèi)表達(dá) 外源蛋白在大腸桿菌胞內(nèi)高效表達(dá)時(shí)通常形成包涵體。 6. 分子伴侶 有效的蛋白質(zhì)翻譯后折疊是由一種被稱為分子伴侶的專職