基因工程制藥ppt課件(2)(已修改)
2025-01-17 09:17 本頁(yè)面
【正文】 第二章 基因工程制藥 基因工程 是將一種生物的基因分離出來(lái)，在體外進(jìn)行酶切和連接插入載體構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，導(dǎo)入另一種宿主細(xì)胞使目的基團(tuán)得到復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。 基因工程可生產(chǎn)的主要藥物是指醫(yī)用 活性蛋白和多肽 ，包括免疫性蛋白、細(xì)胞因子、激素、酶等 。 基因工程藥物生產(chǎn)的過(guò)程 目的基因的獲得 基因的表達(dá) 基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn) 基因工程菌的穩(wěn)定性 基因工程菌的發(fā)酵 基因工程藥物的分離純化 包含體的復(fù)性 基因工程藥物的質(zhì)量控制 基因工程藥物生產(chǎn)的過(guò)程 獲得目的基因 重組質(zhì)粒構(gòu)建 基因工程菌 除菌過(guò)濾 產(chǎn)物分離純化 培養(yǎng)工程菌 包裝 成品檢定 半成品檢定 基因工程的基本要素： 工具酶、目的基因、載體、宿主 上、下游 目的基因的獲得 一、構(gòu)建基因文庫(kù) 提取細(xì)胞基因組 DNA 酶切 克隆至特定載體 雜交或其他方式篩選 基因文庫(kù) 轉(zhuǎn)化特定宿主細(xì)胞 探針 (如根據(jù)氨基酸序列反推過(guò)來(lái)的DNA序列，根據(jù)蛋白保守性得到的同源序列，已知的部分 DNA序列 ) 獲取目的基因 適合于無(wú)內(nèi)含子的原核生物 二、構(gòu)建 cDNA文庫(kù) 適合于真核生物基因克隆。 提取細(xì)胞mRNA 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第一鏈 cDNA第二鏈的合成 雜交篩選或其他方式篩選 cDNA文庫(kù) 轉(zhuǎn)化特定宿主細(xì)胞 探針 獲取目的基因 cDNA片斷與載體連接 三、 PCR方式 先決條件：已知目的基因的 DNA序列。 原核：以基因組為模板 反轉(zhuǎn)錄 PCR（ RTPCR）： 提取 mRNA， 反轉(zhuǎn)錄生成cDNA作為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增獲得目的基因。 四、化學(xué)合成 已知基因或蛋白質(zhì)全長(zhǎng)序列，合成短的寡核苷酸片斷，拼接為長(zhǎng)的 DNA片斷，再用連接酶連接成完整基因。 基因表達(dá) 基因表達(dá)： 結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯及所有的加工過(guò)程。 一、宿主細(xì)胞的選擇 首要條件： 能夠生產(chǎn)出有活性的目的產(chǎn)物 。 其他條件： 容易獲得較高濃度的細(xì)胞； 產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高； 能利用易得廉價(jià)原料； 不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素； 容易進(jìn)行 DNA重組技術(shù)操作； 產(chǎn)物容易提取純化。 表達(dá)系統(tǒng)的分類： 原核表達(dá)體系 （ 1）大腸桿菌 ：目前采用最多的原核表達(dá)體系。 革蘭氏陰性菌 優(yōu)勢(shì)： 遺傳背景清楚，基因組序列已確定； 生長(zhǎng)迅速，平均 20~30min繁殖一代； 易于培養(yǎng)，生產(chǎn)成本低，適合大規(guī)模培養(yǎng)； 外源基因表達(dá)水平高，可達(dá)總蛋白的 5~30％以上； 有大量可供選擇利用的克隆和高效表達(dá)載體。 缺點(diǎn)： ? 缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng)，缺少糖基化功能 ； ? 沒(méi)有有效釋放蛋白到培養(yǎng)基中的分泌機(jī)制 ； ? 表達(dá)的外源蛋白多形成包涵體，蛋白的復(fù)性較困難 ； ? 翻譯目的蛋白 N端常多一個(gè)甲硫氨酸殘基（ AUG編碼）。 （ 2）枯草芽孢桿菌 革蘭氏陽(yáng)性菌，其基因組測(cè)序已經(jīng)完成。 胞外分泌能力強(qiáng)； 有很多可用的質(zhì)粒載體； 無(wú)糖基化功能； 具有很強(qiáng)的胞外蛋白酶活性，對(duì)目的產(chǎn)物有不同程度降解。 （ 3）鏈霉菌 優(yōu)點(diǎn)： 對(duì)人畜基本無(wú)致病性； 已
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