基因工程制藥ppt課件(2)(編輯修改稿)
2025-02-01 09:17 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 X m a I ( 9 4 0 )A p a L I ( 1 9 )A p a L I ( 1 4 7 6 )A p a L I ( 2 7 2 2 )A p a L I ( 3 6 3 2 )1. 有效的表達載體 (1) 載體的復(fù)制 松弛型的載體可增加基因的拷貝數(shù)，有利于外源基因表達。 高拷貝數(shù)的質(zhì)粒加強菌的代謝負荷，會影響菌體生長，不利于表達。 1. 有效的表達載體 (2) 啟動子 大腸桿菌啟動子由 10區(qū)和 35區(qū)組成，兩者之間通常間隔 16~18個核苷酸。 通常采用強啟動子表達蛋白； 誘導型啟動子可人為控制蛋白表達時機； 在表達毒性蛋白或?qū)λ拗饔泻Φ耐庠吹鞍讜r，需要采用強抑制型的啟動子，以減少外源蛋白的本底轉(zhuǎn)錄。 質(zhì)粒 啟動子 誘導方式 提供商 pBV220 λPLPR串聯(lián)啟動子 42度熱誘導 pET系列 T7 IPTG Novagen pThioHisA,B,C trc IPTG Invitrogen pBAD系列 araBAD L阿拉伯糖 Invitrogen pQE系列 T5 IPTG Qiagen pGEX系列 tac IPTG GE 1. 有效的表達載體 (3) 核糖體結(jié)合位點（ RBS） 與翻譯起始 RBS是翻譯開始時核糖體 30S小亞基識別并結(jié)合的mRNA 部位，包括起始密碼子及其上游 313堿基處長度為 39個核苷酸的 SD序列。 SD位點在翻譯起始階段與 16S rRNA的 339。端互補結(jié)合。 SD序列和 SD與起始密碼子間的距離影響翻譯起始的效率： ? 在間隔相同的情況下，不同 SD序列翻譯效率不同。UAAGGAGG的 SD序列比 AAGGA的 SD序列能使蛋白質(zhì)的產(chǎn)量提高 36倍； ? 對于同一 SD序列，存在一最佳的間隔。 AAGGA的間隔為57個核苷酸，而 UAAGGAGG的間隔為 48個核苷酸； ? 對于同一 SD序列，有一翻譯所必需的最小間隔 。 在 mRNA的翻譯起始區(qū)的二級結(jié)構(gòu)在決定基因表達效率方面具有重要作用： ? 提高 RBS中 A、 T殘基的豐度能增強某些基因的表達； ? 突變 SD區(qū)上游或下游的某些特定核苷酸會抑制 mRNA二級結(jié)構(gòu)的形成和提高翻譯效率； ? 位于起始密碼子下游的密碼子堿基組成，同樣會影響mRNA 539。端的二級結(jié)構(gòu)，可在保留編碼蛋白序列的同時重新構(gòu)建基因的 539。端，使其 A、 T含量增加，減少 mRNA二級結(jié)構(gòu)增加翻譯效率。 1. 有效的表達載體 (4) 終止密碼子 在構(gòu)建表達載體時，通常插入三個終止密碼子以防止核糖體的跳躍。在 UAA密碼子，尤其當其后存在一個 U形成 UAAU時其轉(zhuǎn)錄終止效率最有效 。 1. 有效的表達載體 (5) 轉(zhuǎn)錄終止子 在原核生物中，轉(zhuǎn)錄終止有兩種不同的機制： 其一 ρ蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄終止； 其二是非 ρ依賴性轉(zhuǎn)錄終止作用，它取決于 DNA模板的結(jié)構(gòu)特征，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，如 T7終止子 。 有效的轉(zhuǎn)錄終止子是表達載體必不可少的元件。貫穿啟動子的轉(zhuǎn)錄將抑制啟動子的功能，造成所謂的啟動子封堵。 在編碼序列下游的適當位置放置一轉(zhuǎn)錄終止子，可阻止轉(zhuǎn)錄貫穿別的啟動子。同樣，在目的基因的啟動子上游放置一轉(zhuǎn)錄終止子，將防止上游轉(zhuǎn)錄貫穿帶來的影響，還可最大限度地減小背景轉(zhuǎn)錄。 1. 有效的表達載體 (5) 轉(zhuǎn)錄終止子 由強啟動子啟動的轉(zhuǎn)錄會使轉(zhuǎn)錄通讀到復(fù)制區(qū)，造成控制質(zhì)?？截悢?shù)的 ROP蛋白的過量表達，導致質(zhì)粒的不穩(wěn)定。 轉(zhuǎn)錄終止子增強 mRNA的穩(wěn)定性并減少了核苷酸在細胞中的消耗，從而提高蛋白質(zhì)的表達水平。 1. 有效的表達載體
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