基因工程制藥ppt課件(2)(參考版)
2025-01-08 09:17本頁面
【正文】 三 、 酵母體系中的基因表達(dá) 表達(dá)系統(tǒng)： 載體 、 宿主細(xì)胞 （ 一 ） 表達(dá)載體 1. 載體的復(fù)制序列 四大類： （ 1） YEp類 (yeast episomal plasmid,酵母附加體質(zhì)粒 ) 復(fù)制序列來源于 酵母 2μ質(zhì)粒 拷貝數(shù)： 5~50 高拷貝數(shù)： 100~200 穩(wěn)定性高 （ 2） YRp類 (yeast replicating plasmid,酵母復(fù)制型質(zhì)粒 ) 復(fù)制序列來源于 非 2μ質(zhì)粒的自主復(fù)制序列 (ARS) 如酵母染色體 拷貝數(shù)： 5~10 穩(wěn)定性差 （ 3） YCp類 (yeast centromeric plasmid,酵母著絲粒質(zhì)粒 ) 復(fù)制序列：含 酵母染色體復(fù)制序列 及 酵母染色體中心粒成分 ， 有的含酵母染色體端粒 類似染色體 ， 參與細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂 拷貝數(shù)： 1 穩(wěn)定性好 （ 4） YIp類 (yeast integrative plasmid,酵母整合型質(zhì)粒 ) 含可與酵母染色體重組的 同源序列 整合到染色體上 ， 依靠染色體復(fù)制而復(fù)制 拷貝數(shù)少 (1個或少數(shù)幾個 ) 穩(wěn)定 2. 穿梭載體 可在 大腸桿菌 和 酵母 中復(fù)制 含大腸桿菌質(zhì)粒 pBR322復(fù)制序列 和 抗生素抗性基因 酵母中選擇性標(biāo)記： 抗性基因 或某些 氨基酸或核苷酸合成酶基因 3. 表達(dá)載體 含酵母啟動子和終止子 胞內(nèi)表達(dá)載體 分泌表達(dá)載體 （ 含信號肽序列 ， α因子 ） （ 二 ） 影響目的基因在酵母中表達(dá)的因素 1. 外源基因的劑量 拷貝數(shù) 穩(wěn)定性 對菌生長的影響 2. 外源基因的表達(dá)效率 啟動子 、 終止序列 、 分泌信號 PHO5啟動子 無機(jī)磷調(diào)節(jié)（低磷誘導(dǎo)） 分泌信號： 可利用異源分泌信號 ， 酵母自身分泌信號優(yōu)于其他生物的分泌信號 終止序列： 保證 mRNA在適當(dāng)部位終止 ， 加 polyA, 增強(qiáng) mRNA穩(wěn)定性 3. 外源蛋白的糖基化 N糖鏈 （ 天冬酰胺 ） O糖鏈 （ 絲氨酸 、 蘇氨酸 ） 與天然產(chǎn)物類似 ， 不完全相同 4. 宿主菌株的影響 生長能力強(qiáng) 內(nèi)源蛋白酶較弱 菌株性能穩(wěn)定 （ 突變株 ， 使用二倍體或多倍體 ） 分泌能力強(qiáng) 。 原核分子伴侶（ GroES、 GroEL、 DnaK、 HtpG） 能穩(wěn)定表達(dá)的蛋白折疊中間體，可提高正確折疊的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。 缺點： 對融合蛋白進(jìn)行位點特異性裂解。 成功應(yīng)用的融合擔(dān)體蛋白： 谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶（ GST） 、 麥芽糖結(jié)合蛋白（ MBP） 以及 硫氧還蛋白（ Trx） 等。 小分子量的蛋白（小于 1萬）容易被降解。 (3) 胞外表達(dá) 胞外表達(dá)優(yōu)點： ? 可簡化蛋白質(zhì)的純化； ? 減少蛋白酶對目的蛋白質(zhì)的降解 然而目前還未完全闡明大腸桿菌外分泌的機(jī)理，迄今為止還未設(shè)計出切實可行的在胞外制備大量外源蛋白的方案。 (2) 周質(zhì)腔表達(dá) 在周質(zhì)腔中進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)有以下優(yōu)點 ： ? 有
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1