《基因工程上》ppt課件-全文預(yù)覽
【正文】 克隆。為 α 鏈編碼的基因稱之為 lacZα 。半乳糖苷酶法、 α 互補(bǔ)檢測(cè)法 ) β 半乳糖苷酶是一種把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的酶， 基因產(chǎn)物裝配為四聚體后才有酶活。 當(dāng)培養(yǎng)基中含有抗生素時(shí)， 只有攜帶相應(yīng)抗藥性基因載體的細(xì)胞才能生存繁殖， 這就把凡未能接受載體 DNA的細(xì)胞全部篩除掉了。真核生物包括酵母、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，主要用于外源真核基因的表達(dá)。 人工接頭連接 BamHI BamHI BamHI 同聚物加尾連接 5’ 5’ 5’ 5’ AAA AAA TTT TTT TdT酶 連接酶 (末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 ) 三 、 重組 DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞 外源 DNA(含目的 DNA)與載體在體外連接成重組 DNA分子后，需將其導(dǎo)入受體細(xì)胞 (形成轉(zhuǎn)化子 )。 通過化學(xué)合成的方法合成目的基因 。 PCR 方法 十分簡(jiǎn)捷 。 基因組 DNA文庫(kù) 限制性內(nèi)切酶 基因組 DNA 基因重組 轉(zhuǎn)化細(xì)菌 體外包裝 (二 )制備 cDNA文庫(kù) 以 mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成其互補(bǔ) DNA，再?gòu)?fù)制成雙鏈 cDNA片段，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，擴(kuò)增為 cDNA文庫(kù) (cDNA library) 。 ? 目的基因與噬菌體 DNA進(jìn)行重組時(shí) ， 可采用 插入重組方式 ， 也可采用 置換重組方式 。每一種限制性內(nèi)切酶會(huì)產(chǎn)生不同的粘性末端，可選用兩種內(nèi)切酶組合在質(zhì)粒載體和外源 DNA上產(chǎn)生相同的末端，進(jìn)行雙粘端連接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。 具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增后，每個(gè)細(xì)胞中可累積 10003000個(gè)拷貝，為重組體 DNA的制備提供了極大的方便。 多克隆位點(diǎn) ori 復(fù)制起始點(diǎn) 遺傳標(biāo)記 Amp polylinker 基因載體 (二 )表達(dá)型載體 (expression vector)： 為使插入的外源 DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體 。 如果要將外源 DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)，就需要有一個(gè)能在該宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制和表達(dá)的載體來攜帶。 ? 要求：兩個(gè)雙鏈 DNA片段間存在互補(bǔ)的粘性末端或平頭末端 五 、 堿性磷酸酶 堿性磷酸酶能去除 DNA或 RNA 5ˊ 端的磷酸根 用途： 制備載體時(shí)，用堿性磷酸酶處理后，可防止載體自身連接，提高重組效率 將脫氧核苷酸加到 DNA的 3‘端羥基上 ， 主 要用于探針標(biāo)記；或者在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾 ， 以便于進(jìn)行連接 。 ? 應(yīng)用于： ① 將 mRNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA， 構(gòu)建 cDNA文庫(kù)； ② 補(bǔ)平和標(biāo)記 539。同時(shí)此酶缺乏 339。 5ˊ GOH Klenow 5ˊ GTT*A*AOH 3ˊ CAATTOH d*ATP,dTTP 3ˊ CAA T TOH (三 )TaqDNA聚合酶 TaqDNA聚合酶是一種依賴 DNA的耐熱 DNA聚合酶 主要用于聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)中，能以 DNA為模板，以結(jié)合在模板上的引物為起點(diǎn)，以dNTP為原料，按堿基配對(duì)方式，從 539。?補(bǔ)齊雙鏈 DNA的 3ˊ 末端 。 外切酶 聚合酶 外切酶5 39。 3 39?！?39。 外切酶活性，而失去了 539。 (二 )Klenow片段 ? 用枯草桿菌蛋白酶可將 DNA聚合酶 I裂解為36kD和 76kD兩個(gè)片段， 大片段稱為 Klenow片段 .具有 539。339。339。339。 C C A T GG T A C C 3 39。339。 CC 3 39。339。+A h a ⅢD r a Ⅰ又如 KpnⅠ 和 Asp718Ⅰ 的識(shí)別位點(diǎn)相同，但切割位點(diǎn)不相同，前者產(chǎn)生 339。5 39。 例如： Aha Ⅲ 和 DraⅠ 的識(shí)別和切割序列都相同，產(chǎn)生平端： T T T A A A A A A T T T 539。 G G GG G G 3 39。339。539。G5 39。AC GT C5 39。539。 粘性末端， P s t Ⅰ切割后產(chǎn)生 339。 基因工程的主要內(nèi)容或（步驟） 目的基因 基因載體 重組體 分 切 接 轉(zhuǎn) 篩 表 總體技術(shù)路線 1996年 7英國(guó)愛丁堡羅斯林（ Roslin）研究所用藥物促使母羊排卵，將卵吸空，制成空卵殼，再?gòu)哪秆蛉橄僦腥〕鲆粋€(gè)體細(xì)胞，使它與卵殼合成一個(gè)含有遺傳物質(zhì)的卵細(xì)胞。 在體外，將帶有目的基因的外源 DNA片段 連接 到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組 DNA分子 將重組 DNA分子 轉(zhuǎn)移 到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞 (亦稱寄主細(xì)胞 )，并與之一起增殖。 ? 基因克隆 (gene cloning)。 基因工程的概念： 利用 DNA體外重組或 PCR擴(kuò)增技術(shù)從某種生物基因組中 分離 感興趣的基因 ，或是用人工合成的方法獲取基因 ， 然后經(jīng)過一系列 切割 ， 加工修飾 ， 連接 反應(yīng)形成重組 DNA分子 ， 再將其 轉(zhuǎn) 入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞 ， 以期獲得基因 表達(dá) 的過程 . 基因工程 (gene engineering)常和以下名稱混用 ? 遺傳工程 (geic engineering)。 ? 重組 DNA技術(shù) (rebination DNA technique) 從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因
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