【正文】 體（ MAC） ? 哺乳動物人工染色體（ MAC）指從哺乳動物細胞中分離出復(fù)制起始區(qū)、端粒以及著絲粒構(gòu)建而成的克隆載體。 。 人類游離人工染色體（ HAEC） ? 基于人類 EB病毒（人類皰疹病毒）而構(gòu)建的環(huán)形 DNA，含有 EB病毒 的復(fù)制原點（ oriP）和 潮霉素 （鏈霉菌產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素）抗性基因。 ? 含有卡那霉素抗性基因，便于篩選。 例如，某些基因如人凝血因子 VII基因長達180kb，肌營養(yǎng)不良基因大于 1800 kb． ? 缺點： （ 1）克隆外源基因易出現(xiàn)嵌合體 （ 2）有些克隆不穩(wěn)定 （ 3） YAC克隆不容易與酵母自身染色體相分離 細菌人工染色體（ BAC） ? 細菌人工染色體（ BAC）是以細菌 F因子為基礎(chǔ)構(gòu)建的細菌克隆載體。 第四節(jié) 人工染色體克隆載體 ※ 人工染色體 指人工構(gòu)建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統(tǒng)。 ? 如 Charon 4 載體 （ 凱倫噬菌體載體 ） 常用的 λ噬菌體衍生載體 載體名稱 分子大小 (kb) 可克隆外源 DNA片段大小 (kb) ? Charon 3A 0 – ? Charon 4A 0 – ? Charon 17 0 ? Charon 20 0 – ? Charon 21 A 0 – ? Charon 28 0 – ? Charon 30 0 ? LA 7 –1 0 – ? Sep6lac 5 0 – ? BF 101 46 .0 – M13噬菌體 （一） M13噬菌體性質(zhì) ①絲狀噬菌體，內(nèi)有一環(huán)狀單鏈 DNA分子（“ +‖鏈 DNA） 大小： 結(jié)構(gòu)： 10個區(qū) 基因間隔區(qū)（ IS區(qū)） 含復(fù)制起始位點及可插入外源 DNA的位點 M13噬菌體 ② 復(fù)制與增殖 M13 DNA―+‖鏈進入 雄性大腸桿菌 → 合成 “ ‖鏈 → 產(chǎn)生雙鏈 M13 DNA（復(fù)制型 DNA或 RFDNA） → 按環(huán)狀雙鏈 DNA方式復(fù)制，同時以 “ +‖鏈 DNA為模板轉(zhuǎn)錄包裝蛋白 → RFDNA達 200拷貝時，單鏈 DNA特異結(jié)合蛋白與“ +‖鏈結(jié)合而阻斷合成 “ ‖鏈 → 結(jié)果只能以 “ ‖鏈為模板合成 “ +‖鏈 → “ +‖鏈 DNA被包裝蛋白包裝成新的 M13噬菌體 → 擠出受體細胞 → 宿主細胞不被溶菌。 現(xiàn)知只有雙鏈 DNA的噬菌體才具有溶源周期 λ噬菌體 （一） λ噬菌體性質(zhì) ①組成： λDNA + 外殼蛋白 ? λDNA () ? 噬菌體中：線性 ? 宿主細胞：環(huán)狀 (cos位點 ) λ噬菌體 （一） λ噬菌體性質(zhì) ②是一個溫和噬菌體 ? 一般以溶源生長進行增殖，脅迫條件下也會進入溶菌生長周期。 ⑤離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒 DNA。 ? 通過冷卻或恢復(fù)中性 PH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準確迅速復(fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒 DNA。 反之稱為 隱蔽質(zhì)粒 。 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 ③ 可轉(zhuǎn)移性 在天然條件下 ， 很多天然質(zhì)粒都可以通過細菌接合作用從一種宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種宿主內(nèi) ， 這種轉(zhuǎn)移依賴于質(zhì)粒上的 tra基因產(chǎn)物 。 ※ 在霉菌、藍藻、酵母和一些動植物細胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前對細菌的質(zhì)粒研究得比較深入。 ④ 將雙鏈 DNA的末端轉(zhuǎn)化成為平端 ， ⑤ 使結(jié)合于單鏈 DNA模板上的誘變寡核苷酸引物得到延伸 。 ? 常用的 DNA聚合酶有：耐熱性 DNA聚合酶、大腸桿菌 DNA聚合酶 I、 Klenow酶、T4 DNA聚合酶等。 DNA片段 加連桿 后連接 ? 設(shè)計合成的另一類寡核苷酸連桿由幾十至上百個核苷酸組成，有多種限制酶的識別序列，可作為連桿且被組裝在克隆載體上成為 多克隆位點（ MCS） ，這種連桿即多克隆位點寡核苷酸連桿或簡稱 MCS連桿 。PO4與另一 DNA鏈的 339。巰基乙醇或二硫蘇糖醇（ DTT）以及牛血清白蛋白（ BSA）等 ? 星性（ Star）活性 ? 某些限制性核酸內(nèi)切酶在特定條件下，可以在不是原來的識別序列處切割DNA，這種現(xiàn)象稱為 Star活性 ? Star活性出現(xiàn)的頻率，根據(jù)酶、底物DNA、反應(yīng)條件的不同而不同 ? 星性（ Star）活性 ? 控制反應(yīng)條件，避免 Star活性（避免高濃度的核酸內(nèi)切限制酶 、 高濃度的甘油 、 低離子強度 、 用 Mn2+取代Mg2+以及 高 pH值 等誘導(dǎo)條件） 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） 六、利用限制酶對 DNA進行消化的具體步驟 ※ 建議遵循與酶一起提供的說明書進行操作 ※ 不同限制酶的緩沖液主要差別在于其中所含 NaCl的濃度 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） 六、利用限制酶對 DNA進行消化的具體步驟 ①將 DNA溶液加入一滅菌的微量離心管中并與適量水混勻，使總體積為 18 μ1； ②加入 2μl適當?shù)?10 限制酶消化緩沖液，輕敲管外壁以混勻之； ③加入 1~2單位限制酶，輕彈管外壁以混勻； ④將上述混合的反應(yīng)物置于適當溫度并按所需的時間進行溫育； ⑤酶切反應(yīng)的終止 ⑥酶切結(jié)果分析 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） 七、使用限制酶的注意點 ①小心取用，節(jié)省開支 ； ②操作要盡可能快，用完后立即將酶放回冰箱，以使酶在冰箱外放置的時間盡可能縮短 ； ③盡量減少反應(yīng)中的加水量以使反應(yīng)體積減到最小 ； ④通常延長消化時間可使所需的酶量減少 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） 八、 DNA分子片段化 單酶切法 雙酶切法 部分酶切法 ? 現(xiàn)有一長度為 1000 堿基對（ bp）的 DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶 Eco R1酶切后得到的 DNA分子仍是 1000 bp，用Kpn1單獨酶切得到 400 bp和 600 bp兩種長度的 DNA分子，用 EcoRI、 Kpnl同時酶切 后得到 200 bp和 600 bp兩種長度的DNA分子。 ? 基因操作中使用稀切酶可獲得大的片段。 ? 同裂酶的切點位置可相同或不同。 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） 一、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) ? 細菌細胞的 限制 — 修飾 體系 ? 1978年， 、 amp。 第三節(jié) 基因工程研究的內(nèi)容 相關(guān)名詞術(shù)語 ? 遺傳工程（ Geic engineering） ? 基因工程（ Gene engineering） ? 基因操作（ Gene manipulation） ? 重組 DNA技術(shù)（ Rebinant DNA technique） ? 基因克?。?Gene cloning） ? 基因修飾（ Geic modification） ? 分子克隆 （ Molecular cloning） 遺傳工程 和 基因工程 的差別 ? 遺傳工程 是指以改變生物有機體性狀特征為目標的遺傳信息量的操作（ the manipulation of the information content），它既包括常規(guī)的選擇育種 ，也包括相對 復(fù)雜的基因克隆 等不同技術(shù)層次。然后直接利用轉(zhuǎn)化子，或者將克隆的分子自轉(zhuǎn)化子分離后再導(dǎo)入適當?shù)谋磉_體系，使重組基因在細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生特定的基因產(chǎn)物 （賀淹才， 《 簡明基因工程原理 》 ）。 光明日報維也納 2022年 9月 5日電 美國汽車從人畜嘴里搶糧！ 基因工程 是現(xiàn)代生物技術(shù)的 核心 動植物改良 生物制藥 蛋白質(zhì)工程 組織工程 代謝工程 細胞工程 基因工程 美科學(xué)家首次提出 : 人類智商和基因有關(guān) 智商天賦與基因檢測 美科學(xué)家培育出 首個轉(zhuǎn)基因人類胚胎 第一章 緒論 基因工程概況 教學(xué)目的和要求： ? 掌握基因工程的基本概念 ? 熟悉基因工程的基本原理和過程 ? 了解基因工程的發(fā)展歷史和重要成就 第一章 緒論 基因工程概況 ? 第一節(jié) 基因工程的 誕生 ? 第二節(jié) 基因工程的 成就 ? 第三節(jié) 基因工程 研究的內(nèi)容 第一節(jié) 基因工程的誕生 理論與技術(shù)支持 ? 理論上的三大發(fā)現(xiàn)： ①證明了生物的遺傳物質(zhì)是 DNA ② DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機理 ③中心法則和三聯(lián)體密碼子系統(tǒng)的建立 （ 1） 肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗 （ 2）噬菌體轉(zhuǎn)染實驗 DNA是遺傳物質(zhì) DNA雙螺旋結(jié)構(gòu) DNA半保留復(fù)制機理 中心法則 DNA RNA protein 三聯(lián)體密碼子系統(tǒng) 第一節(jié) 基因工程的誕生 理論與技術(shù)支持 ? 技術(shù)上的三大發(fā)現(xiàn)： ①限制性內(nèi)切酶和 DNA連接酶的發(fā)現(xiàn) ②載體的使用 ③逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn) 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) DNA連接酶