《植物基因工程》ppt課件-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 0~12a g r 對(duì) P A T K 84 質(zhì)粒編碼的農(nóng)桿菌素敏感 138~141 －a r c 分解精氨酸 4~5 9~10a g c 分解農(nóng)桿堿 － 54~57noc 分解胭脂堿 18~20 －nos 合成胭脂堿 0~1 －oc c 分解章魚堿 － 39~41oc s 合成章魚堿 － 0~1or i 復(fù)制起點(diǎn) 33~35 90~95ps c 分解磷酸化的糖 136~138 －r oi ( t m r ) 抑制長(zhǎng)根 206~207 190~192s h i ( t m s ) 抑制長(zhǎng)芽 202~203 187~188t r a Ti 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移 121~123 21~30i nc 質(zhì)粒不相容性 33~35 90~95 T－ DNA 結(jié)構(gòu)： 胭脂堿型的 TDNA是 15kb長(zhǎng)的 DNA連續(xù)片段，占 Ti 的 715％，兩邊有 23bp的定向重復(fù)序列。 T－ DNA TDNA攜帶的遺傳信息 （ 1）致瘤基因：用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的基因，使植物不受控制地繁殖 ――致癌基因（ onc基因）。 證據(jù) 2. nos、 ocs等基因的 5’末端具有真核特有的TATAbox和 CAATbox。 Vir的基因結(jié)構(gòu)： 章魚堿型 Ti 的 Vir區(qū)： 40kb，含 8個(gè)操縱子，24個(gè)基因 [VirA(1)、 B（ 11）、 C（ 2）、 D（ 4）、E（ 2）、 F（ 1）、 G（ 1）、 H（ 2）（ PinF） ]、它們協(xié)同調(diào)節(jié)、形成一個(gè)調(diào)控子，共同起作用。 農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化機(jī)理 Vir基因的誘導(dǎo) VirA和 VirG被結(jié)構(gòu)性表達(dá) T－ DNA的加工及轉(zhuǎn)移 TDNA鏈整合植物基因組 農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化機(jī)理 Vir基因的誘導(dǎo) 細(xì)菌處于易感受傷植物附近，受傷植物產(chǎn)生酚類物質(zhì)（如煙草組織產(chǎn)生的乙酰丁香酮），誘導(dǎo) Ti 中 Vir 基因的表達(dá)。 VirA和 VirG結(jié)構(gòu)性表達(dá) 酚類 激活 VirA（膜上疏水蛋白） VirG VirGP 不表達(dá)的基因 Vir活化，開始表達(dá) 轉(zhuǎn)錄因子與專一的 12bp序列結(jié)合 農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化機(jī)理 T－ DNA的加工及轉(zhuǎn)移 （ 1）農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞后，只留在細(xì)胞間隙中。 T— DNA的復(fù)制 VirD蛋白的作用： （ 1）保護(hù) 5’端不被5’核酸酶攻擊； （ 2） TDNA進(jìn)入植物細(xì)胞核的向?qū)? VirE蛋白的作用： 編碼 ssDNA結(jié)合蛋白，與單鏈 TDNA結(jié)合，包被 T鏈成核蛋白絲，便于運(yùn)轉(zhuǎn)。 A：可能作為能源，作為一種 ATP酶促使 T復(fù)合體被泵出細(xì)菌細(xì)胞。 VirB4是一種富集蛋白，無(wú)疏水區(qū)，無(wú)信號(hào)肽，可能在 T鏈轉(zhuǎn)運(yùn)中起一種結(jié)構(gòu)作用，形成至少一部分特殊的通道結(jié)構(gòu)。 （引自 Vogel等， 1992） 農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化機(jī)理 TDNA鏈整合植物基因組 在靶 DNA上形成一個(gè)缺刻，由于部分解旋， 5`3`外切酶消化形成缺口。 （ 3）農(nóng)桿菌中的質(zhì)粒一般在命名中要表示出來(lái)。它是構(gòu)建中間表達(dá)載體的基礎(chǔ)質(zhì)粒。它是由中間表達(dá)載體和卸甲載體構(gòu)建而成。 （ 4）引入的衍生質(zhì)粒和原細(xì)胞中 Ti質(zhì)粒具同源性，因而可產(chǎn)生無(wú)性配對(duì)重組，通過(guò)交換，可將目的基因轉(zhuǎn)到 Ti質(zhì)粒上，使之產(chǎn)生真正的具有外源基因的 Ti質(zhì)粒，稱共整合質(zhì)粒。 載體盒 （ 1）所謂 “ 載體盒 ” (Vector cassette)是將植物的標(biāo)志基因、多插入位點(diǎn)、細(xì)菌標(biāo)志基因和質(zhì)粒的復(fù)制啟動(dòng)子位點(diǎn)等集于一身的質(zhì)粒系統(tǒng)，象一個(gè)集裝箱似的集合在一起。 受體系統(tǒng) ：用于轉(zhuǎn)化的外植體通過(guò)組織培養(yǎng)途徑或其它非組織培養(yǎng)途徑（如發(fā)苗產(chǎn)生子葉、胚軸等），能高效、穩(wěn)定地再生無(wú)性系，并能接受外源 DNA整合，對(duì)轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。 常遇到的問(wèn)題 ? 試管苗玻璃化現(xiàn)象：植株矮小，腫脹，半透明，葉片淺或黃綠。 ? 試管苗移栽成活率 4. 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化程序 根癌農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移 （ 1）通過(guò)感染植物進(jìn)行 Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移 （ 2）平板雜交：供體菌及受體菌混合培養(yǎng)在瓊脂板 上實(shí)現(xiàn) Ti質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移 （ 3）凍融法： Ti質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化法 根癌農(nóng)桿菌對(duì)植物的轉(zhuǎn)化 （ 1）根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、純化、保存。 （ 3） dsRNA病毒（反轉(zhuǎn)錄病毒） （ 4） dsDNA病毒：如花揶菜花葉病毒（ CaMV，在專一位點(diǎn)有不連續(xù)性，有 35S強(qiáng)啟動(dòng)子，易表達(dá)） （ 5） ssDNA植物病毒 植物病毒作為轉(zhuǎn)化載體的基本條件 （ 1）可使用基因插入，如將抗病性基因?qū)氩《据d
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