【正文】 GG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG C Xa2 ATC GAA GGT CGC GAA AAG CTT CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GC Xa3 NruI HindIII PvuII BamHI KpnI EcoRV BglII SmaI NotI Xa因子切割位點 寡聚型異源蛋白的表達 從理論上講，外源基因的表達水平與受體細胞中可轉(zhuǎn)錄基因的拷貝數(shù)（即 基因劑量 ）呈正相關(guān)。 用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提條件是外 源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或 賴氨酸殘基，如果外源基因表達產(chǎn)物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但 大分子量的異源蛋白來說，上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率是相當(dāng)高的 Arg C N N C 受體蛋白 目的蛋白 融合型異源蛋白的表達 目的蛋白的回收 酶促裂解法： 多殘基位點 為了克服僅切單一氨基酸殘基的蛋白酶所帶來的應(yīng)用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼 寡肽序列 （ IleGluGlyArg） 的人工接頭片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的 凝血因子 Xa的識別和作用序列，其斷裂位點在 Arg的C末端 。然而，如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法 化學(xué)斷裂法： 融合型異源蛋白的表達 目的蛋白的回收 酶促裂解法： 單殘基位點 蛋白內(nèi)切酶 切割位點 梭菌蛋白酶 ArgC 葡萄球菌蛋白酶 GluC 假單孢菌蛋白酶 LysC 豬胰蛋白酶 ArgC LysC 蛋白酶酶促裂解法的特點是斷裂效率更高， 同時每種蛋白酶均具有相應(yīng)的 斷裂位點決定 簇 ，因此可供選擇的專一性斷裂位點范圍較 廣。融合蛋白的位點專一性斷裂方法有兩種： 化學(xué)斷裂法 酶促裂解法 融合型異源蛋白的表達 目的蛋白的回收 用于蛋白位點專一性化學(xué)斷裂的最佳試劑為 溴化氰 （ CNBr）它與多肽鏈中的 甲硫氨酸 殘基側(cè)鏈的 硫醚基 反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個多肽降解片段其中 上游肽段 的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為 高絲氨酸 殘基，而下游肽段 N端的第一位氨基酸殘基保持不變。在實際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段 行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白 目的蛋白溶解性好 由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在 目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和進一步分離，才能獲 融合型異源蛋白的表達 融合型目的蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建 融合蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建原則： 受體細胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達，且其表達產(chǎn)物可以通過親和 層析進行特異性簡單純化 兩個結(jié)構(gòu)基因拼接位點處的序列設(shè)計十分重要，它直接決定著 為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件 外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終 止密碼子。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常受體細菌的蛋白部分位于 N端，異源蛋白位于 C端。 融合型異源蛋白的表達 除了直接表達異源蛋白外，還可將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個開放型 閱讀框架 進行表達。 因此，只要將細菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個合適的質(zhì)粒上 即可構(gòu)建完全分泌型的受體細胞。如若將外源基因與大腸 桿菌的 信號肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達，其 N端 的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中被有效除去 分泌型異源蛋白的表達 以分泌形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點 分泌表達形式的缺點： 相對其它生物細胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機制并不健全。蛋白產(chǎn)物 N端 信號肽 序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前提條件 分泌型異源蛋白的表達 以分泌形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點 分泌表達形式的優(yōu)點： 目的蛋白穩(wěn)定性高 重組人胰島素原若分泌到細胞周中，其穩(wěn) 穩(wěn)定性大約是在細胞質(zhì)中的 10倍 目的蛋白易于分離 目的蛋白末端完整 相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白 N端并不含有 甲硫氨酸殘基。在變性操作結(jié)束后，這些游離型的巰基必須重新 配對形成二硫鍵，此時多肽鏈也重新發(fā)生折疊。包涵體中的蛋白質(zhì)就屬于這兩種狀態(tài)，因此需要在體外進行人 工變性（解除共價修飾和驅(qū)散集聚體）復(fù)性操作 包涵體型異源蛋白的表達 包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的溶解與變性： 包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開錯配的 二硫鍵 和 次級鍵 在人工條件下，使包涵體溶解并重新進入復(fù)性途徑中。因此，以包涵體形式表達目的基因操作的關(guān)鍵就是選擇高表達的載體。除此之外，包涵體中還含有少量的 DNA、 RNA和脂多糖等非蛋白分子 包涵體型異源蛋白的表達 以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點 能簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作 包涵體表達形式的優(yōu)點： 包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來 能在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用基本上對異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅 包涵體型異源蛋白的表達 以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點 包涵體表達形式的缺點： 以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。 富含蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。由此構(gòu)建的大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細胞對外源基因高效表達的制約作用 同步表達相關(guān) tRNA編碼基因 質(zhì)粒拷貝數(shù) 質(zhì)?？截悢?shù)對細菌生長代謝的影響 目前實驗室里廣泛使用的表達型質(zhì)粒在每個大腸桿菌細胞中可達數(shù)百甚至上千個拷貝，質(zhì)粒的擴增過程通常發(fā)生在受體細胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時正是細菌生理代謝最旺盛的階段。例如，在 人尿激酶原 cDNA的 412個密碼子中，共含有 22個 精氨酸密碼子 ，其中 7個 AGG、 2個 AGA， 而大腸桿菌受體細胞中 tRNAAGG和 tRNAAGA的豐度較低。除此之外，從 AUG開始的前幾個密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與 mRNA的 5’ 端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會嚴重干擾 mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位 目前廣泛用于外源基因表達的大腸桿菌表達型質(zhì)粒上，均含有與啟動子來源相同的核糖體結(jié)合位點序列，序列和間隔是最佳的 密碼子 生物體對密碼子的偏愛性 不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼 子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是： 生物基因組中的堿基含量 在富含 AT的生物（如單鏈 DNA噬菌體 fX174） 基因組中，密碼子第三位上的 U和 A出現(xiàn)的頻率較高；而在 GC 豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有 G或 C的簡并密碼子 占 90%以上的絕對優(yōu)勢 密碼子與反密碼子相互作用的自由能 性中等強度規(guī)律 細胞 內(nèi) tRNA的含量 如 GGG、 CCC、 GCG、 GGC、 AAA、 UUU、 AUA、 UAU等使用少； 如 GUG、 CAC、 UCG、 AGC、 ACA、 UGU、 AUC、 UUG等使用多； 密碼子 密碼子偏愛性對外源基因表達的影響 由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程 大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高 效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。緊鄰AUG的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響，對于大腸桿菌 b半乳糖苷酶的 mRNA而言，在這個位置上最佳的堿基組合是 UAU或CUU， 如果用 UUC、 UCA或 AGG取代之，則酶的表達水平低 20倍 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響 SD序列與起始密碼子之間的距離的影響 ： SD序列與起始密碼子之間的精確距離保證了 mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子 AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的 P位，這是翻譯啟動的前提條件。 mRNA翻譯的起始效率主要由其 5‘ 端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為 核糖體結(jié)合位點 （ RBS） 核糖體結(jié)合位點 大腸