【正文】 91）。1 His表位標簽和金屬螯合親和層析 金屬螯和親和層析技術(shù)是由Porath及其合作者在70年代中期發(fā)展起來的，這一方法基于蛋白質(zhì)表面的一些特定的氨基酸殘基側(cè)鏈，尤其是組氨酸，在中性和弱堿性條件下可以和固定化的金屬離子相互作用，如Ni2+、Zn2+和Co2+，目前His標簽已經(jīng)成為應(yīng)用最為廣泛的親和標簽。它的主要優(yōu)點如下：1 標簽的分子量小，一般不影響目標蛋白的功能；2 His標簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強的蛋白得到應(yīng)用，后者在純化包涵體蛋白時特別有用，用高濃度的變性劑溶解后通過金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復(fù)性不受其它蛋白的干擾，或進行金屬螯和親和層析復(fù)性，前面已作了介紹；3 His標簽融合蛋白也被用于蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)DNA相互作用研究；4 His標簽免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫制備抗體；5 可應(yīng)用于多種表達系統(tǒng)，純化的條件溫和；6 可以和其它的親和標簽一起構(gòu)建雙親和標簽。His標 簽也有一些缺點，如融合蛋白易形成包涵體，包涵體蛋白難于溶解，融合蛋白溶解后不能正確復(fù)性，層析時螯和的金屬離子容易泄漏（會使蛋白的氨基酸側(cè)鏈氧化， 純化的得率降低，制品中殘留金屬離子對細胞、組織有毒性），金屬鰲和親和層析的非特異性結(jié)合會造成制品的純度不高，針對這些問題，現(xiàn)在發(fā)展的 His親和表達純化系統(tǒng)克服了其中的某些缺點，如使用結(jié)合金屬離子強的親和介質(zhì)NiNTA和TALON，使用HAT標簽（HAT標簽為雞乳酸脫氫酶的一段序列），六個組氨酸被其它氨基酸隔開，沒有正電荷聚集的現(xiàn)象，可改善溶解性和得率。硫氧還蛋白（thioredoxin）作為融合標簽可以促進蛋白的可溶性表達，Lu等將硫氧還蛋白表面的4個氨基酸殘基進行系統(tǒng)性的突變，發(fā)現(xiàn)E30H和Q62H兩個組氨酸突變可以使硫氧還蛋白螯和固定化的鎳離子，S1H突變可以進一步促進這種相互作用，從而給硫氧還蛋白打上一個組氨酸補?。╤istine patch），同時保留了野生型分子促進可溶性表達的能力，突變蛋白hpTrxA和野生型硫氧還蛋白融合表達的水平相一致，并能用金屬螯和層析方便的進行融合蛋白的純化（104）。在親和純化中，常規(guī)使用的介質(zhì)有NiIDA、NiNTA和TALON親和介質(zhì)，圖6 畫出了相應(yīng)三種螯和配體的化學結(jié)構(gòu)，最早使用的IDA和Ni2+有三個結(jié)合位點，結(jié)合位點在一個平面上，結(jié)合力也最弱，所以在純化中的泄漏也最多，NTA和Ni2+有4個結(jié)合位點，TALON和Co2+也有4個結(jié)合位點，形成立體的結(jié)合，結(jié)合力較強，泄漏也較少。根據(jù)產(chǎn)品的介紹，TALON對蛋白質(zhì)組氨酸的排列有要求，為相鄰的組氨酸或處于特殊位置的兩個組氨酸，而這一點對NiNTA則不那么嚴格，所以TALON對His標簽融合蛋白的選擇性也就更高，非特異性蛋白結(jié)合就更少。 圖6 用于金屬螯和層析的螯和配體。結(jié)合位點的原子用圓形邊框注釋，sp代表間隔臂，M代表基質(zhì)。2 谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶蛋白標簽 谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶蛋白（GST）標簽是最早使用的親和標簽，目標蛋白加于GST的C端，再利用谷胱甘肽親和介質(zhì)進行純化，或固定在親和介質(zhì)上進行蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用研究，GST pulldown實驗已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)相互作用的常用方法。用于親和純化的GST來源于日本血吸蟲，由于其分子量較大，而且以二聚體的形式存在溶液中，一般都需要去除融合標簽。這一系統(tǒng)必須依賴于GST的正確折疊，幸運的是一般GST融合蛋白包涵體在溶解復(fù)性后都能正確折疊。GST融合蛋白也常用來免疫動物生產(chǎn)抗體，以及作為載體蛋白進行一些蛋白的結(jié)晶。GST標簽常被選擇用于增加可溶性表達，但實際上并不有效， Waugh的小組選擇了10個可溶性表達不好的蛋白作為研究對象，GST融合并不能增強負載蛋白的可溶性表達（103,106）。3 基于Protein A和Protein G的親和標簽 Protein A廣泛的用于純化IgG分子，它是金黃色葡萄球菌的細胞壁成分，可以特異性的結(jié)合免疫球蛋白的Fc區(qū)。Protein A前體蛋白由信號肽序列、5個同源的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域和細胞表面錨定序列組成，同源的5個IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠分別結(jié)合IgG，Protein A已廣泛的用于抗體的純化。作為親和融合的標簽，Protein A具有以下優(yōu)點：1 在各種宿主細胞中，Protein A耐蛋白酶的降解，高度穩(wěn)定；2 每個IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域形成3螺旋捆狀結(jié)構(gòu)，兩端都是親水的結(jié)構(gòu)，使得Protein A的折疊不依賴于目的蛋白的折疊；3 Protein A不含有半胱氨酸，否者可能干擾目的蛋白二硫鍵的形成；3 Protein A高度可溶，在變性條件下復(fù)性的效率高，有助于融合蛋白包涵體的溶解和折疊；4 可引入不同的酶切位點，不影響目標蛋白的酶切；5 加上信號肽序列，可使融合蛋白進行大腸桿菌周質(zhì)表達，某些情況下，可進行胞外表達。為了使融合蛋白耐溴化氰和羥胺處理，對5個IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的B結(jié)構(gòu)域進行了結(jié)構(gòu)改造，替換了溴化氰和羥胺處理敏感的氨基酸，就有了Z標簽，越來越多的應(yīng)用更優(yōu)先選用Z標簽和它的雙體ZZ標簽。除了大腸桿菌以外，在其它的表達系統(tǒng)（酵母、植物細胞、昆蟲細胞、CHO細胞）中已成功的表達了Protein A和ZZ融合蛋白。由于基于Protein A的親和標簽的親和性比較高，要在相對劇烈的條件下（低pH）進行洗脫，所以可能造成目標蛋白的失活，另一個問題就是IgG親和層析介質(zhì)較貴，并且不耐清洗處理。G252。lich等對Protein A進行了結(jié)構(gòu)改造，降低結(jié)合的強度，（102）。鏈球菌Protein G是存在于某些鏈球菌菌株表面的雙功能受體，可以同時結(jié)合IgG和白蛋白，并且這兩段功能區(qū)域在結(jié)構(gòu)上分離。白蛋白結(jié)合區(qū)域在大腸桿菌中表達高度可溶，性質(zhì)穩(wěn)定，不被蛋白酶降解，結(jié)合上信號肽能有效的分泌。這一區(qū)域的不同部分BB、ABP和ABD被用于一步人白蛋白親和層析純化（結(jié)合有種屬特異性，對人的白蛋白結(jié)合最強），并在多種表達系統(tǒng)中得到應(yīng)用。基于Protein G的親和標簽最重要的用途在于傳輸?shù)鞍踪|(zhì)藥物，融合蛋白的白蛋白結(jié)合特性使得目標蛋白的血漿半衰期延長，增強了療效。BB融合標簽還可以刺激目的蛋白的抗體響應(yīng)，可用于免疫動物生產(chǎn)抗體。4 能與抗生物素蛋白特異性結(jié)合的親和標簽 生物素抗生物素蛋白（AvidinBiotin）是目前所知的最強的親和作用之一，其解離常數(shù)Kd為1015M，然而太強的結(jié)合使得重組蛋白很難在相對溫和的條件下洗脫下來，所以需要在親和標簽/配體對的特異性和解離常數(shù)之間尋找一個平衡。體外也可對蛋白賴氨酸殘基進行生物素化標記，但不具有特異性，不能用于親和純化，研究者轉(zhuǎn)向?qū)ふ殷w內(nèi)可特異性生物素化的多肽，并把它用于親和融合策略。 很少有蛋白在體內(nèi)可以被生物素化修飾，乙酰輔酶A的生物素羧基載體蛋白（BCCP）是存在于大腸桿菌（E. coli）的唯一一個可生物素化蛋白，生物素在生物素連接酶（BirA）的催化下特異性的修飾其中的一個賴氨酸殘基，研究表明其C末段101個氨基酸的肽段已經(jīng)具有可被生物素化的功能，Promega的PinPoint載體就編碼這個標簽，使用其SoftLink親和素（即抗生物素蛋白）介質(zhì)可以在弱的條件下洗脫融合蛋白（5mM生物素溶液）。 Strep Tag 系統(tǒng)是通過篩選噬菌體隨機肽庫而得到的短肽（含9個氨基酸殘基），將其進行目標蛋白的C端融合可以模擬生物素和鏈霉抗生物素蛋白特異性相互作用，使用亞胺生物素洗脫。這一系統(tǒng)不能進行N端融合，而且變性劑會影響親和相互作用。后來發(fā)展的8氨基酸Strep tag Ⅱ標簽，與Strep Tag相似，本身并不能生物素化，但卻可以模擬生物素的功能和鏈霉抗生物素蛋白變體StrepTactin特異性的相互作用，可加在蛋白的N端和C端，使用便宜的脫硫生物素進行洗脫，而且Strep tag Ⅱ和StrepTactin相互作用不受變性劑的影響，可在變性條件下純化。 AviTag由篩選肽庫得到15 個氨基酸的短肽，具有一個單生物素化賴氨酸位點，與已知天然可生物素化一致序列完全不同，可以加在目標蛋白的N端和C端，融合表達后，可被生物素連接酶BirA（細菌具有內(nèi)源性的生物素連接酶，但為了使重組蛋白完全生物素化，感受態(tài)細菌已轉(zhuǎn)化高水平表達生物素連接酶的質(zhì)粒）生物素化，為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白質(zhì)分離純化，還用于蛋白質(zhì)相互作用研究。5 麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP） 大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白是malE基因的產(chǎn)物，定位在細胞的周質(zhì)空間，可以特異性的結(jié)合麥芽糖或糊精麥芽糖復(fù)合物，協(xié)助這些物質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)。這一系統(tǒng)使用交聯(lián)直鏈淀粉的親和介質(zhì)純化，用麥芽糖進行競爭性洗脫，具有如下優(yōu)點：1 MBP不含有半胱氨酸殘基，不會干擾目標蛋白形成正確的二硫鍵；2 使用的介質(zhì)價格低廉；3 可以在溫和的條件下洗脫融合蛋白；4 加上其分泌信號，可以進行分泌表達在細胞周質(zhì)，由于周質(zhì)是偏氧化的環(huán)境，可以促進目標蛋白形成正確的二硫鍵；5 這一系統(tǒng)最顯著的特點是與麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）進行融合表達可以改善目標蛋白的溶解性，促進正確折疊，提高活性蛋白的回收率，實驗證明MBP比硫氧還蛋白和GST都要有效（103,106）。與硫氧還蛋白不同，MBP進行C端融合也可以促進蛋白的可溶性表達（107），擴展了MBP的應(yīng)用。一般認為MBP促進可溶性表達與它具有分子伴侶樣的特性有關(guān)，MBP可以直接的和折疊中間體相互作用，抑制聚集的發(fā)生，從而使它區(qū)別于別的標簽（103,109,110）。6 鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（CBP） 鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（CBP）有26個氨基酸殘基，來源于骨骼肌肌球蛋白輕鏈激酶C末段，鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽與鈣調(diào)素結(jié)合是Ca2+依賴的，這種結(jié)合不受標簽所處的位置影響（N端和C端均可），在中性pH條件下使用2mM EGTA可以很方便的將目標蛋白洗脫下來。這一系統(tǒng)有如下優(yōu)點：1 特異性很高，因為大腸桿菌沒有可以和鈣調(diào)素結(jié)合的蛋白；2 與His標簽相比可以在強還原性條件下純化。7 纖維素結(jié)合肽（CBD） 纖維素結(jié)合肽（CBD）融合蛋白能與纖維素介質(zhì)特異性的結(jié)合，可以在溫和的條件下洗脫（乙二醇或低鹽條件），pET CBD 載體含有纖維素結(jié)合肽（CBD）的序列，可方便克隆構(gòu)建。8 幾丁質(zhì)結(jié)合肽 New England Biolabs 提供的IMPACT（InteinMediated Purification with an affinity Chitinbinding Tag）系統(tǒng)使用幾丁質(zhì)結(jié)合肽（來源于環(huán)狀芽胞桿菌）作為融合標簽，表達的融合蛋白可以用幾丁質(zhì)親和層析純化，利用內(nèi)含肽（intein）的特異性原位剪切直接獲得目標蛋白。這一系統(tǒng)包括以下幾類：1 巰基誘導(dǎo)的N端剪切系統(tǒng)（相對內(nèi)含肽來講），有pTYB1和其衍生載體，使用的內(nèi)含肽來源于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）VMA1基因，將最后一個氨基酸進行了N454A突變，使內(nèi)含肽的C端不能被剪切，在巰基試劑的誘導(dǎo)下，內(nèi)含肽的N端發(fā)生重排、裂解、水解，就得到目標蛋白，由于細菌表達，目標蛋白N端有甲硫氨酸，C端不引入額外的氨基酸殘基；2 巰基誘導(dǎo)的C端剪切系統(tǒng)，有pTYB11和pTYB12載體，同樣使用來源于釀酒酵母VMA1基因的內(nèi)含肽，內(nèi)含肽C端的剪切依賴于其Ｎ端剪切位點的巰基誘導(dǎo)裂解，幾丁質(zhì)結(jié)合肽序列插入到內(nèi)含肽的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，Ｎ端為半胱氨酸的蛋白不能使用這一系統(tǒng)剪切；３ pH誘導(dǎo)的C端剪切系統(tǒng)，有pTWIN 載體，內(nèi)含肽來源于一種藍細菌的dnaB基因，有429個氨基酸殘基，N端的半胱氨酸殘基被丙氨酸殘基取代，使內(nèi)含肽不具有N端的裂解活性，而保留C末端pH誘導(dǎo)剪切的特性，剪切能有效進行，pH，內(nèi)含肽的N端融合幾丁質(zhì)結(jié)合肽，C端融合目標序列，在pH ℃條件下剪切； 4可以用于蛋白質(zhì)環(huán)化的雙內(nèi)含肽系統(tǒng)，目的蛋白處于兩個內(nèi)含肽之間，先通過pH誘導(dǎo)目標蛋白N端內(nèi)含肽被剪切，再用巰基試劑誘導(dǎo)C端內(nèi)含肽被剪切，剪切后產(chǎn)生N端為半胱氨酸殘基和C端為硫脂鍵的蛋白，通過自發(fā)的縮合可形成環(huán)化蛋白。與傳統(tǒng)的親和融合系統(tǒng)相比，這一系統(tǒng)的最大優(yōu)點在于不需要使用蛋白酶來去除融合標簽。9 FLAG表位標簽，T7表位標簽和S標簽 FLAG肽序列（DYKDDDDK）的親水性很強，片段小，并且具有腸激酶的酶切位點，一般不會影響目標蛋白的活性。FLAG標簽的最初用途是用于蛋白檢測，可以在飛摩爾水平特異性檢測目標蛋白，Sigma將3個FLAG表位（DYKD）串聯(lián)，中間以兩個氨基酸間隔，可以將蛋白分析靈敏度提高1020倍?？笷LAG的單克隆抗體M1和FLAG結(jié)合是Ca2+依賴的，加入螯和劑可以在溫和的條件下將融合蛋白洗脫，但M1 抗體只能結(jié)合處在N端最外面的FLAG標簽，所以只可用于去除信號肽后的FLAG融合蛋白。篩選的M2抗體可以和前面多一個甲硫氨酸的FLAG標簽或C端的FLAG標簽結(jié)合，但這種結(jié)合是Ca2+非依賴的，需要使用低pH洗脫，或用合成的FLAG肽進行競爭性洗脫。這一系統(tǒng)可在多種表達系統(tǒng)中使用，主要的缺點是M1和M2親和介質(zhì)特別昂貴。T7 標簽為T7 基因10蛋白的最前面11個氨基酸，通過免疫親和層析進行純化。S標簽為15 個氨基酸的多肽標簽，可以特異性的和S蛋白介質(zhì)結(jié)合。由于S標簽和S蛋白結(jié)合形成有活性的核糖核酸酶，可以靈敏的定量檢測融合蛋白。16 / 16