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2025-07-07 12:04本頁面
【正文】 將分離膠放入染色液，置搖床上緩慢搖動，染色4h以上或過夜。染色液：90ml甲醇:水（1:1），10ml乙酸。注意：戴一次性手套操作，以免手上染色。（2）取出分離膠，用蒸餾水漂洗數(shù)次，將膠放入脫色液，置搖床上緩慢搖動24小時，直至背景藍(lán)色褪淡，見到條帶，期間應(yīng)更換脫色液34次。脫色液：90ml甲醇:水（1:1），10ml乙酸。注意：戴一次性手套操作，以免手上染色；回收染色液，可反復(fù)使用多次。（3）測量蛋白質(zhì)Marker中各蛋白質(zhì)、溴酚藍(lán)、重組蛋白質(zhì)的遷移距離，計算它們的相對遷移率Rf，利用蛋白質(zhì)Marker中各蛋白質(zhì)的相對遷移率Rf和各蛋白質(zhì)的分子量作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線推算重組蛋白的分子量。硝酸銀染色（1）固定：配制固定液（500 ml乙醇，100乙酸，400ml dd H2O），處理至少30min。（2）浸泡：配制浸泡液（75ml乙醇，17g乙酸鈉， 25% 戊二醛，用dd H2O溶解后加至250ml），浸泡30 min。（3）漂洗：用dd H2O漂洗三次，每次5min。（4）銀染：配制銀染液（，50μl甲醛，用dd H2O溶解后加至250ml），染色20 min。（5）顯色：配制顯色液（，25μl甲醛，用dd H2O溶解后加至250ml），浸泡后輕輕搖動210min，仔細(xì)觀察蛋白帶，至深棕色時立即加入終止液。（6）終止：配制終止液（ EDTANa22H2O，用dd H2O溶解后加至250m），（5）中出現(xiàn)的蛋白帶轉(zhuǎn)變?yōu)樯钭厣珪r加入終止液，終止反應(yīng)。（7）漂洗：用dd H2O漂洗三次，每次5min。（8）測量蛋白質(zhì)Marker中各蛋白質(zhì)、溴酚藍(lán)、重組蛋白質(zhì)的遷移距離，計算它們的相對遷移率Rf，利用蛋白質(zhì)Marker中各蛋白質(zhì)的相對遷移率Rf和各蛋白質(zhì)的分子量作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線推算重組蛋白的分子量。步驟試劑時間（1）固定500 ml乙醇，100乙酸，400ml dd H2O至少30min（2）浸泡75ml乙醇，17g醋酸鈉，30 min 25% 戊二醛，用dd H2O溶解后加至250ml（3）漂洗用dd H2O漂洗三次5 min /每次（4）銀染，50μl甲醛20 min用dd H2O溶解后加至250ml（5）顯色，25μl甲醛210 min視蛋白帶至深棕色用dd H2O溶解后加至250ml（6）終止 EDTANa2 2H2O10 min用dd H2O溶解后加至250m（7）漂洗用dd H2O漂洗三次5 min /每次五、思考題SDS在蛋白質(zhì)電泳中有何作用？試說明SDSPAGE中的幾個不連續(xù)性產(chǎn)生的效應(yīng)？有哪些方法可以測定重組蛋白的分子量？6 / 6
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