基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)、純化和分析-資料下載頁
2025-09-11 20:44本頁面
【正文】 TEMED 用手輕搖約 2分鐘混勻 (注意不要產(chǎn)生氣泡 ） ,小心將混合液注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中 ， 為濃縮膠留足夠的空間 ， 輕輕在頂層加入幾毫升去離子水復(fù)蓋 ， 以阻止空氣中氧對(duì)凝合的抑制作用 。 剛加入水時(shí)可看出水與膠液之間有界面 ， 后漸漸消失 ， 不久又出現(xiàn)界面 ， 這表明凝膠已聚合 。 再靜置片刻使聚合完全 。 ！ 注意：為避免凝膠過快聚合 ， 配膠用的無離子水 、 30%的凝膠液及 TrisHCl緩沖液應(yīng)事先于 4℃ 或冰上放置 ,以下同 。 3. 濃縮膠的制備：先吸去已聚合好的分離膠上層的水 ， 用水洗界面一次 ， 再用濾紙吸干殘留的水液 。 按下列配方制備 5毫升濃縮膠溶液 ?；旌虾髮⑵渥⑷敕蛛x膠上端 ， 插入梳子應(yīng)小心避免氣泡 。 去離子水 30% 凝膠液 TrisHCl() 10% SDS 10% AP TEMED 4. 在濃縮膠聚合的同時(shí) ， 將樣品與 5 樣品緩沖液 （ 16μL＋ 4μL） 混合 ， 100℃ 加熱 3分鐘以變性蛋白質(zhì) 。 Sample1,2用 600μL起始緩沖液懸浮 ， 取 16μL同上操作 。 5. 濃縮膠聚合完全后 ， 小心地拔出梳子 ， 用無離子水沖洗梳孔 ， 將凝膠模板放入電泳槽上固定好 ， 上下槽均加入 1X電泳緩沖液 ， 檢查有無漏液 ， 除去兩玻璃板間凝膠底部的氣泡 ，上樣前用上槽緩沖液沖洗梳子孔 。 6. 按次序上樣：用微量進(jìn)樣器往凝膠梳孔中加樣品混合液 ， 20μL/孔 ， 一孔加一個(gè)樣品 ， 同時(shí)安排已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物作對(duì)照 。 7. 電泳：開始時(shí)濃縮膠電壓為 80V， 染料進(jìn)入分離膠后 ， 將電壓增到 120V， 繼續(xù)電泳至染料 （ 溴酚藍(lán) ） 到分離膠底部 ， 斷開電源 。 8． 固定及染色：取下凝膠放入大培養(yǎng)皿 ， 用考馬斯藍(lán)染色液固定并染色 ， 最好放在搖床緩慢轉(zhuǎn)動(dòng) 30min 。 9． 脫色：先用水洗去染料 ， 再放入脫色液 Ⅰ 中浸泡 ， 更換 12次 ， 至條帶清晰 ， 背景呈淡藍(lán)色 ， 然后換脫色液 Ⅱ ， 至背景清晰 ， 約 4h8h。 10． 將脫色后凝膠中的蛋白質(zhì)分離色帶照相或干燥 。 也可無限期地用塑料袋封閉在含 20%甘油的水中 。 1 2 3 4 5 1：細(xì)菌總蛋白（含 pBSK）； 2：未經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)菌總蛋白（含pGFPuv）； 3：經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)菌總蛋白（含 pGFPuv）； 4：穿流峰流出液； 5：純化的 GFPuv。 1 2 3 4 5 6 7 1： Marker； 2：細(xì)菌總蛋白（含 pUC18）； 3：未經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)菌總蛋白（含 pGFPuv）； 4：經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)菌總蛋白（含 pGFPuv）。 Marker L1 L2 L3 L4 L5 L6 L1：細(xì)菌總蛋白（含 pUC18） sample1； L2：未經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)菌總蛋白（含 pGFPuv） sample2； L3：經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)菌總蛋白（含 pGFPuv）sample3 ； L4：穿流峰流出液 sample4 ； L5： 50mmol/L咪唑洗脫液 sample5； L6： 純化的 GFPuv sample6。 提交電泳圖： 六． 注意事項(xiàng) 1. 制備聚丙烯酰胺凝膠時(shí) ， 如果倒膠后出現(xiàn)漏膠液現(xiàn)象 ， 常常是因?yàn)槎K玻璃板與塑料條之間沒夾緊 ， 留有空隙 ， 所以這一步要特別留心操作 。 2. 點(diǎn)樣總量一般不超過 20μL， 如果點(diǎn)樣量太多而溢出梳孔 ， 就會(huì)污染旁邊泳道 。 要根據(jù)樣品濃度來加樣 。 每點(diǎn)一個(gè)樣品后換一支吸頭或清洗吸頭后再點(diǎn)另一個(gè)樣品 。 3. 電泳完畢取凝膠時(shí)要小心細(xì)致 ， 不能用死力弄壞玻璃板 （ 尤其是凹形板 ） 。 4. 固定及染色：考馬斯亮藍(lán)染色液蓋過凝膠即可 ， 染色后染色液要回收 ， 可重復(fù)使用多次 。 七． 實(shí)驗(yàn)安排 SDSPAGE，觀察結(jié)果并拍照。 八． 思考與討論 1. 在不連續(xù)體系 SDSPAGE中 ,當(dāng)分離膠加完后 ,需在其上加一層水 ,為什么 ? 2. 電極緩沖液中甘氨酸的作用 ? 3. 在不連續(xù)體系 SDSPAGE中 ,分離膠與濃縮膠中均含有 TEMED和 AP,試述其作用 ? 4. 樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘 ?
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