【正文】 基攪拌混合后 ， 該化合物隨即分散成微珠 ， 細胞貼附于上并擴增 ， 停機后離心 ， 兩相自動分開 ， 細胞自動懸浮于兩相之間 。 ?大孔微載體：細胞可鉆到內(nèi)部 ， 加大了載體表面積 ， 細胞的抗性增加 。 微囊化培養(yǎng)方法 ? 將細胞包繞在營養(yǎng)物質(zhì)可以自由進出的半透膜內(nèi) ， 細胞在微囊內(nèi)擴增表達 。 由于囊膜保護 ， 使細胞不易受到機械損傷 。 根據(jù)微囊的截留值不同 ，分泌表達物質(zhì)可被截留在位囊膜內(nèi) ，培養(yǎng)結(jié)束后破囊提取 ， 也可釋放到囊膜外 ， 易于分離 。 基因工程制藥 重組蛋白的分離與純化 不同部位表達效果鑒定 ?溶菌酶消化后離心取上清 ?反復凍融后離心取上清 ?超聲破碎后離心取沉淀 ?電泳確定重組蛋白在周質(zhì) ,細胞質(zhì)及包涵體中的分布情況。 基因工程菌的裂解方法 ? 高速球磨法：珠子與與細胞間碰撞剪切 ? 高壓勻漿法：高壓擠壓，高速噴出碰撞 ? 超聲破碎法：高頻震動，沖擊波剪切力 ? 酶溶解法：消化細胞膜與細胞壁 ? 化學滲透法：去垢劑、金屬鰲合劑、變性劑、有機溶劑 ? 凍融破碎法：膜疏水鍵斷裂，冰晶 膨脹 包涵體的溶解 ? 在復性純化前，必須使包涵體充分變性、溶解。 ? 不含二硫鍵多肽的可用 8M尿素或 6M鹽酸胍等變性劑溶解，有時也要加還原劑。 ? 含二硫鍵的多肽需添加 2MT或 DTT等還原劑，必要時需排空氣，充氮氣，使二硫鍵充分還原。 ? 加入 EDTA或 EGTA，用來抑制金屬離子與還原狀態(tài)的巰基間發(fā)生的氧化反應和抑制某些酶。 ? 加入蛋白酶抑制劑等。 變性蛋白的層析純化 ? 凝膠過濾法：在含有變性劑和還原劑的條件下進行層析分離，流速要慢。此法可能是大規(guī)模生產(chǎn)中的一個限速步驟。 ? 離子交換法：變性劑對離子交換的效果可能有一定影響。由于高濃度鹽酸胍的高離子強度，其變性液中的蛋白質(zhì)不能用于離子交換分離。 重組蛋白的復性操作 ? 目前重組蛋白已達數(shù)千多種，其中大腸桿菌表達占 90%以上 ， 絕大多數(shù)以包涵體形式存在，只有復性才能恢復其活性。 ? 折疊復性是一個非常復雜的過程，除對復性過程的控制相關(guān)外，還蛋白質(zhì)本質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復性，有些蛋白體外根本無法復性。至今也沒找到針對大多數(shù)蛋白質(zhì)體外復性的通用方法。 體外復性的影響因素 ? 蛋白質(zhì)在復性過程中涉及兩種疏水作用 ， 分子內(nèi)的疏水作用 ， 可促進蛋白質(zhì)正確折疊；二是分子間的疏水作用 ， 會導致蛋白質(zhì)聚集 。 ? 復性過程中有三類二硫鍵配合方式 ， 即分子內(nèi)正確 、 分子內(nèi)錯誤及分子間錯誤配合方式 。 ? 肽鏈折疊還受到周圍環(huán)境的影響 ， 如溫度 、pH值 、 離子強度 、 復性時間等因素的影響 。 包涵體蛋白 分子內(nèi)二硫鍵的正確配對 折疊 折疊 聚集 聚集 沉淀 沉淀 還原態(tài) 天然態(tài) 聚集 聚集 沉淀 沉淀 共價 共價 共價 共價 蛋白折疊過程中的動力學模型 影響復性效率的因素 ? 蛋白質(zhì)的復性濃度：不要過高 ， 防止聚集 。 ? pH和溫度：復性環(huán)境 pH值一般在 89， 防止巰基的質(zhì)子化作用而影響二硫鍵的形成 。 ? 影響因素還有，變性劑的起始濃度和去除速度、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。 常用的復性促進劑 ? 氧化 還原劑： GSH/GSSG、 DTT/GSSG、Cystine /Cysteine等。提高正確配對二硫鍵的產(chǎn)率。 ? 小分子的添加劑：鹽酸胍或尿素、碳酸酰胺類等，甘油及肝素等阻止蛋白聚集。 ? 去垢劑及表面活性劑：如 Trition X100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜堿等。 ? 添加分子伴侶和折疊酶 。 稀釋復性 ? 直接加入水或緩沖液 ， 缺點是體積增加較大 ， 變性劑稀釋速度太快 ， 不易控制 。 方 法主要有一次稀釋 、 分段稀釋和連續(xù)稀釋三種方式 。 ? 一般在尿素濃度 4M左右時復性過程開始，到 2M 左右時結(jié)束。復性時變性劑濃度應高到足以有效防止聚集，同時又必須低到能夠引發(fā)正確復性的程度。 透析與超濾復性 ? 透析復性：通過逐漸降低透析外液變性劑濃度來控制變性劑的去除速度 ， 此法較易形成無活性蛋白質(zhì)集聚 ， 且不適合大規(guī)模操作 ， 無法應用到生產(chǎn)規(guī)模 。 ? 超濾復性： 易于對變性劑去除速度進行控制 ， 在生產(chǎn)中較多的使用 。 柱上復性 ? 柱上 復性是蛋白質(zhì)變性構(gòu)象向天然構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程中抑制集聚的有效方法，效果優(yōu)于稀釋、透析等方法。其優(yōu)點是： ? 由于色譜介質(zhì)對蛋白質(zhì)有一定的吸附作用，可明顯減少變性蛋白在脫離變性劑后產(chǎn)生的分子間的聚集沉淀而提高復性質(zhì)量和回收率。 ? 可使復性和分離同時進行。 凝膠過濾復性 ? 利用變性蛋白與變性劑間分子量相差懸殊的差異，通過分子篩效應與變性劑分離。對蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)無特殊要求。 ? 對有些復雜程度低的蛋白質(zhì)可以一次復性。 ? 對于較為復雜的蛋白質(zhì)可以進行梯度復性，可采用連續(xù)梯度和不連續(xù)梯度 。 離子交換復性 ? 在低鹽緩沖液中將變性蛋白吸附在離子交換層析柱上，逐漸降低過柱緩沖液中的變性劑濃度，最后進行梯度洗脫，蛋白不斷在固相表面進行吸附與解吸附，實現(xiàn)復性與分離的同步化。 離子交換復性 親和層析復性 ? 變性蛋白與吸附在固定相上的配體特異性結(jié)合，除抗原抗體，酶與底物等外，還包括金屬螯合和脂質(zhì)體親合色譜。 疏水色譜復性 ? 在高鹽緩沖液中，變性蛋白的疏水氨基酸吸附在疏水固定相上，在高鹽環(huán)境下逐漸減少變性劑的濃度，逐步形成折疊中間體。逐漸降低緩沖液中的鹽濃度，使變性蛋白不斷在固相表面進行吸附與解吸附，逐漸完成向天然構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，同時實現(xiàn)復性與分離的同步化。復性效果較為理想。 折疊復性色譜 ? 將折疊輔助分子與固定相結(jié)合，折疊輔助分子可為變性蛋白提供質(zhì)容納單個分子的疏水腔，避免了蛋白分子間的相互聚集作用，使變性蛋白分子在疏水環(huán)境中不斷進行吸附與解吸附，逐漸恢復天然構(gòu)象。使過去無法復性的蛋白質(zhì)得以復性，同時避免了在溶液中引入折疊輔助分子，復性后再分離的麻煩。 謝