sds-page檢測(cè)重組蛋白-文庫吧資料
2025-07-13 12:04本頁面
【正文】 及側(cè)面，以免PAGE膠液泄漏。主要試劑（1）用于SDSPAGE凝膠的制備：30%丙烯酰胺凝膠母液（丙烯酰胺:雙甲叉丙烯酰胺=29:1），20%SDS， M TrisHCl（）， M TrisHCl（），10%過硫酸銨（AP），四甲基乙二胺（TEMED），去離子水；（2）用于SDSPAGE凝膠的電泳：1Tris甘氨酸電泳緩沖液；（3）用于SDSPAGE凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色：甲醇，乙酸，考馬斯亮藍(lán)；（4）用于SDSPAGE凝膠的硝酸銀染色：乙醇，乙酸，乙酸鈉，25%戊二醛，硫代硫酸鈉，硝酸銀，甲醛，碳酸鈉，EDTANa22H2O。此外，使用凝膠掃描或影像文件處理系統(tǒng)，便可以很快讀出目的蛋白的分子量。量出目的蛋白的遷移距離，計(jì)算出相對(duì)遷移率，就可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出其分子量。另外，我們還可以根據(jù)蛋白質(zhì)Marker中各種蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而更精確地測(cè)定目的蛋白的分子量。根據(jù)分子量相近的蛋白質(zhì)具有相近的遷移率這一原則，可以借助于蛋白質(zhì)Marker初步確定目的蛋白的分子量。例如本實(shí)驗(yàn)中采用的低分子量蛋白質(zhì)Marker為BBI公司產(chǎn)品，由磷酸酶b（兔子肌肉）、牛血清蛋白（牛）、卵清蛋白（雞蛋白）、碳酸苷酶（牛）、溶菌酶（雞蛋白）五種蛋白質(zhì)組成， kD， kD， kD， kD， kD。蛋白質(zhì)或亞基分子量的測(cè)定，可根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（蛋白質(zhì)Marker）測(cè)定，或根據(jù)相對(duì)遷移率進(jìn)而更精確地測(cè)定分子量。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)亞基的分子量在15~200 kDa之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。但長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與亞基分子量的大小成正比。在快慢離子的移動(dòng)速度相等的穩(wěn)態(tài)建立后，二者之間形成一個(gè)穩(wěn)定而又不斷向陽極移動(dòng)的界面，而蛋白質(zhì)的有效遷移率在快慢離子之間，因此也就聚集在這個(gè)移動(dòng)附近，被壓縮成一個(gè)狹小的中間層。電泳開始后，由于快離子遷移率大，就會(huì)很快超過蛋白質(zhì)，在快離子后面形成一個(gè)離子濃度低的區(qū)域即低電導(dǎo)區(qū)，有較高的電位梯度，使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速泳動(dòng)。（3）電位梯度的不連續(xù)。Gly的解離度增加，其遷移率就超過蛋白質(zhì)，因此氯離子和甘氨酸離子沿著離子界面繼續(xù)前進(jìn)。電極緩沖液中的Gly（甘氨酸），%，因而在電場(chǎng)中遷移率很小，稱為慢離子或尾隨離子。在兩層凝膠中均有Tris（三羥甲基氨基甲烷）及HCl。因而在兩層凝膠交界處，由于凝膠孔徑的不連續(xù)性，使樣品遷移受阻，而壓縮成很窄的區(qū)帶。（1）凝膠層的不連續(xù)。SDSPAGE分離不同蛋白質(zhì)時(shí)的高分辨率，不僅是因?yàn)榫郾０纺z介質(zhì)本身的特點(diǎn)，還歸功于在電泳時(shí)采用了不連續(xù)系統(tǒng)。解聚后的氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，這就消除了不同分子之間原有的電荷差異。強(qiáng)還原劑，如β巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）則能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。這個(gè)方法可
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