【正文】 純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 ?通常聚丙烯酰胺凝膠 （ 不連續(xù) ） 電泳有三種效應(yīng)： ① 電荷效應(yīng)； （ 電泳物所帶電荷的差異性 ） 。 ② 凝膠的分子篩效應(yīng) 。 （ 凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及電泳物的大小形狀不同所致 ） ③ 濃縮效應(yīng) ， （ 凝膠濃度的不連續(xù)性 、 緩沖液離子成分的不連續(xù)性 、 電位梯度的不連續(xù)性以及 pH的不連續(xù)性所致 ） 。 因此 ， 樣品分離效果好 ， 分辨率高 。 摟免穗旦驗(yàn)?zāi)诿驓⒏鶋韭憔以⑻K陌迸祖盧泊毯蹭謹(jǐn)?shù)ぷV組入芥億諷基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 ?SDSPAGE， 是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn) SDS（ 十二烷基磺酸鈉 ） 。 SDS破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；強(qiáng)還原劑使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂 ， 因此 ， 蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的 SDS溶液中 ， 與 SDS分子按比例結(jié)合 ， 形成帶負(fù)電荷的 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物 。 這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的 SDS， 降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異 。而由于 SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按大小成比例的 ，在進(jìn)行電泳時(shí) ， 蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小 。 當(dāng)分子量在 15KD到 200KD之間時(shí) ， 蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系 ， 符合下式： logMW=KbX， 式中：MW為分子量 ， X為遷移率 ， k、 b均為常數(shù) 。 赦玲貫多循撒艱柱荔兵他喇赫秘史重逐仟蹄煉翼航填付瓷抨蛇七患類缸百基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 三． 試劑 ① 30%的凝膠貯備液 : Acr 29g + Bis 1g溶于 100mL去離子水中 。 避光貯存棕色瓶中 。 ② 3M TrisHCl (): Trisbase + 48mL 1M HCl + dH2O至100mL ③ 5 Tris甘氨酸電泳 buffer（ ): + 甘氨酸 94g + 5gSDS + H2O至1L（ 用時(shí)稀釋 5倍 ） 。 延晰行悄然拈脂覺鵝仕箭持憑醫(yī)章討苯盜硝麗兩皚寢爍橇撕符像臉課杉梁基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 ④ 10%SDS： 10g SDS溶解于 100mL去離子水中 ，貯存于室溫中 。 ⑤ TrisHCl(): Trisbase + 48mL 1M HCl + dH2O至100mL ⑥ TEMED(四甲基乙二胺 ):濃度 10%， 20 mL (共用 ) ⑦ 10% AP(過(guò)硫酸銨 ):10 mL， 1g AP溶解于10mL去離子水中 ， 新鮮配制 。 酷鴿瞎幫記盅荷杰彭始噓價(jià)噓慕行眾督珠燎奸桌刨哄蔽款莽淖餒舉幀彎膘基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 ⑧ 2x樣品緩沖液 ： 100mM TrisHCl() 200mM DTT(二硫蘇糖醇 ) 4% SDS % 溴酚藍(lán) 20% 甘油 ⑨ 考馬斯亮藍(lán)染色液： R250溶于 45mL甲醇中 ， 加 10mL冰醋酸 + H2O至100mL。 （ 濾紙過(guò)濾除去不溶物 ） ⑩ 脫色液： 75mL冰乙酸 + 50mL甲醇 + 875mL H2O（ 如只配 500mL， 各物質(zhì)減半 ） 棄娃祝春跨啊癥矚哨特適卡幕再螟函益霓預(yù)褐谷郵株尤瓜遙邱痊戚滇聰嗡基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 四． 實(shí)驗(yàn)儀器 電泳儀 、 垂直板電泳裝置 、 微量進(jìn)樣器 （ 50μ L） 、 染色 /脫色搖床等 。 多蔫響野健皚蔭衰答規(guī)朋塢葷這肌壤姚采昂硼韋衫邏帆雹佛岸夠鑿隴盈銥基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 五． 操作步驟 1. 膠板模型的安裝：在干凈的帶隔板的玻璃板的三條邊上把橡膠條壓上，然后將另一塊凹形玻璃板壓上，放入電泳槽中。（示范） 2. 12%分離膠的制備 （ 每次配 10 mL） 去離子水 30% 凝膠液 3mol/L TrisHCl() 10% SDS 10% APS TEMED 民搗木仲江礁氣靛牢俊捕啤蹬郴幼絡(luò)墑蜘奢增墓慫穆棲那卉撮靖畫船貫惕基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 用手輕搖約 2分鐘混勻 (注意不要產(chǎn)生氣泡 ） ,小心將混合液注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中 ， 為濃縮膠留足夠的空間 ， 輕輕在頂層加入幾毫升去離子水復(fù)蓋 ， 以阻止空氣中氧對(duì)凝合的抑制作用 。 剛加入水時(shí)可看出水與膠液之間有界面 ， 后漸漸消失 ， 不久又出現(xiàn)界面 ， 這表明凝膠已聚合 。 再靜置片刻使聚合完全 。 ！ 注意：為避免凝膠過(guò)快聚合 ， 配膠用的無(wú)離子水 、 30%的凝膠液及 TrisHCl緩沖液應(yīng)事先于 4℃ 或冰上放置 ,以下同 。 雛騷譬域拴掖粘賒恰框閉渴販銑洛禾棒藩澈兢冬哩戈儀掂凋婦弦遣涌監(jiān)利基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 3. 濃縮膠的制備：先吸去已聚合好的分離膠上層的水 ， 用水洗界面一次 ， 再用濾紙吸干殘留的水液 。 按下列配方制備 5毫升濃縮膠溶液 ?；旌虾髮⑵渥⑷敕蛛x膠上端 ， 插入梳子應(yīng)小心避免氣泡 。 去離子水 30% 凝膠液 TrisHCl() 10% SDS 10% AP TEMED 素全駐寵仆廟片藐惺銜豁審層醒烹曙器西吞釋揭?guī)肇澤繙喚壻I皺焙怪戈基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 4. 在濃縮膠聚合的同時(shí) ， 將樣品與 5 樣品緩沖液 （ 16μL＋ 4μL） 混合 ， 100℃ 加熱 3分鐘以變性蛋白質(zhì) 。 Sample1,2用 600μL起始緩沖液懸浮 ， 取 16μL同上操作 。 5. 濃縮膠聚合完全后 ， 小心地拔出梳子 ， 用無(wú)離子水沖洗梳孔 ， 將凝膠模板放入電泳槽上固定好 ， 上下槽均加入 1X電泳緩沖液 ， 檢查有無(wú)漏液 ， 除去兩玻璃板間凝膠底部的氣泡 ，上樣前用上槽緩沖液沖洗梳子孔 。 6. 按次序上樣：用微量進(jìn)樣器往凝膠梳孔中加樣品混合液 ， 20μL/孔 ， 一孔加一個(gè)樣品 ， 同時(shí)安排已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物作對(duì)照 。 撩晉掄樊皿惶逛京韋軋棒簇廈鯉輛焙煎遏卡幫攘芹滬據(jù)貴恒肖險(xiǎn)虹丟德貪基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 7. 電泳：開始時(shí)濃縮膠電壓為 80V， 染料進(jìn)入分離膠后 ， 將電壓增到 120V， 繼續(xù)電泳至染料 （ 溴酚藍(lán) ） 到分離膠底部 ， 斷開電源 。 8． 固定及染色：取下凝膠放入大培養(yǎng)皿 ， 用考馬斯藍(lán)染色液固定并染色 ， 最好放在搖床緩慢轉(zhuǎn)動(dòng) 30min 。 9． 脫色：先用水洗去染料 ， 再放入脫色液 Ⅰ 中浸泡 ， 更換 12次 ， 至條帶清晰 ， 背景呈淡藍(lán)色 ， 然后換脫色液 Ⅱ ， 至背景清晰 ， 約 4h8h。 10． 將脫色后凝膠中的蛋白質(zhì)分離色帶照相或干燥 。 也可無(wú)限期地用塑料袋封閉在含 20%甘油的水中 。 陷很局泵轄惰吸茄拜擁皿粵邁癥瑯硅薊逸姬笑圾擺層逮兌鶴恕擊亡誹娶張基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 1 2 3 4 5 1：細(xì)菌總蛋白（含 pBSK）； 2：未經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)菌總蛋白（含 pGFPuv）； 3：經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)菌總蛋白（含pGFPuv）； 4：穿流峰流出液； 5：純化的 GFPuv。 臃雜墊南滯垛