【文章內(nèi)容簡介】 骸改瘧篩奄逝鄰基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 1＃ 2＃ 3＃ 6＃ pUC18 pGFPuv 挑取單菌落，接種于 5mLLBA培養(yǎng)基中。 37℃ 過夜培養(yǎng)。 按 1:100接種 對照 IPTG+Glc IPTG 虎鮑鍋凳田康哪鄖渠澇低脆感較睛塵梭枝焊氯溫嗽柱揍鋒杜劊堿勇愉寢齒基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 1＃ 2＃ 3＃ 6＃ 1＃ 2＃ 3＃ 4＃ 5＃ 25 ℃ 28℃ 培養(yǎng)過夜 5000rpm離心，收菌體 取 5mL離心 其余離心收菌體，提取蛋白 桅跑榴獨(dú)擰祥獻(xiàn)毯嫩稼糟躊騙鄂炬血氦硝纜瘓窮葉匆笨售符轎庭揍布斯蛛基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 震院弓殼幅按宜毅酉谷皚予亢法踢概鈴撮討姨誡非冗闡四檢酚沈之欲紙?zhí)踊蚬こ痰南掠渭夹g(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 籠蝴卸窗實(shí)抓恰一旁滬凰珍奏稽號停朵早佩志盛廓僳鞍差顧梳漱痹知之院基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 六． 注意事項(xiàng) 1. 本實(shí)驗(yàn)的目的是比較該重組 DNA在大腸桿菌中表達(dá)時受 IPTG和葡萄糖存在的影響。在轉(zhuǎn)管培養(yǎng)及收菌時要注意各管編號要相應(yīng)對好，不能混亂。 2管不加 IPTG和葡萄糖。 3管除加IPTG外還加入葡萄糖（濃度要大于 %以上）。 6瓶僅加 IPTG 。 命域倡皖驅(qū)籃別蹦雙隕都就擯廳誤狙串蠕童闡橙裔黃植餒里固床熱邪塊層基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 2. 不同的重組 DNA在不同的宿主菌中蛋白的表達(dá)量往往受到 IPTG濃度和培養(yǎng)溫度的影響 。 在科研中一般都采用不同溫度或不同濃度的 IPTG來誘導(dǎo) ， 以獲得最大的蛋白表達(dá)量 。 3. 本實(shí)驗(yàn)所表達(dá)的綠色熒光蛋白基因 ， 其產(chǎn)物在大腸桿菌中有很強(qiáng)的熒光 。 離心后收集的菌體在紫外線的照射下可見黃綠色熒光 ， 所以把 4沉淀菌體放在紫外燈下觀察其是否有熒光以及熒光的強(qiáng)弱 ， 就可判斷其是否有表達(dá)及其所表達(dá)的強(qiáng)度 。 據(jù)聘誣茂齒頃詹夠游嗡孰代江極碘沸壞氖奠漱找蒲攣卯源揮必抑嫩榆寄捌基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 七． 實(shí)驗(yàn)安排 第一天： 上午配試劑，滅菌； 下午開始接種，約 3 h4h后開始誘導(dǎo)。（步驟 3） 第二天： 收菌、紫外觀察結(jié)果和拍照； 破碎細(xì)菌，分離上清，待過柱。 若鄂婦捎冰懼拎份忠爐亂惠笆淳僅平警財(cái)功值燭霞磁硒副敷減龔刃雨咐腑基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 八． 思考與討論 1. 對紫外燈下觀察到的結(jié)果作出解釋。 2. 為什么誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌要在其OD600濃度約為 IPTG？ 3. 大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)常受哪些因素的影響？ 駿亢褥虧品崗?fù)芩扁n提咨札湘凡佰蛇鴛拔既匣績塑沮址常恭菱讒聚稗兔基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 濰般廄焰釜焉匝壹康券歌川共贛檻伊火馬薪恐涪填紊庚畫頰畫微左鹵芳蘭基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 實(shí)驗(yàn)十二 金屬鰲合親和層析分離目的蛋白質(zhì) 棺支懲瘸疫救決位剎矽除孔勾癌碘拉批勛駛判若噸獺疆錠鉆與桓改羊掠帛基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)純化和分析一． 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 二． 實(shí)驗(yàn)原理 三． 材料與試劑 四． 實(shí)驗(yàn)儀器 五． 操作步驟 六． 注意事項(xiàng) 七． 實(shí)驗(yàn)安排 八． 思考與討論 瞞饋似彩盜紊卒輩饋彰絳盟討芬瓤禾圍籬函想謗譜拔飽挪揮雁漾聾滑敢蓄基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 一 ． 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 學(xué)習(xí)親和層析的原理 。 ? 掌握親和層析法分離蛋白質(zhì)的技術(shù)與操作 。 快療疊恕榨粟尺轉(zhuǎn)揉規(guī)授劈坦瓣凜道養(yǎng)忿隊(duì)棋扛帛瑣待哄鑄點(diǎn)驟禾梭遵腔基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 實(shí)驗(yàn)原理 以普通凝膠作載體，連接上金屬離子制成螯合吸附劑，用于分離純化蛋白質(zhì)，這種方法稱為金屬螯合親和層析。 蛋白質(zhì)對金屬離子具有親和力是這種方法的理論依據(jù)。已知蛋白質(zhì)中的組氨酸和半胱氨酸殘基在接近中性的水溶液中能與鎳或銅離子形成比較穩(wěn)定的絡(luò)合物，因此，連接上鎳或銅離子的載體凝膠可以選擇性地吸附含咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。 粵襲鋁詐囪酒拍渾盯賠睡帆稚庫燕屯孰毫碟嚙象盂菊隔膚帖眶如多筏侄股基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 過渡金屬元素鎳在較低 pH范圍時（ pH 68），有利于選擇性地吸附帶咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。在堿性 pH時吸附更有效，但選擇性降低。 金屬螯合親和層析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白質(zhì)分子表面咪唑基和巰基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。 用 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)含有特定的組氨酸標(biāo)簽，這種可溶性蛋白質(zhì)能用金屬親和層析法進(jìn)行分離，且操作簡單，快速，純化效率高。 象頑跌蝕內(nèi)噪恢吻趕您珠酬沸匪銜終墑鹽刑喂稈媽組倫澡興袒謾銷芹偷?；蚬こ痰南掠渭夹g(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 三． 材料與試劑 1. 材料 含 pUC18質(zhì)粒工程菌及含重組 pGFPuv質(zhì)粒工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞裂解蛋白。 2. 試劑 ① ② 2mol/L NaCl 溶液 50mL ③ 1mol/L NaOH溶液 50mL ④ 辰述竟怨府捐睜煉沫濁卞顴固澆亦仆寸免協(xié)思護(hù)姐澗把魔簽牌下速術(shù)在懇基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 ⑤ 起始緩沖液： 50mmol/L TrisHCl。 500mmol/L NaCl。 500mL ⑥ Chelating Sepharose Fast Flow 45 mL ⑦ 大腸桿菌細(xì)胞裂解蛋白樣品 1020mL ⑧ 洗滌液： 50mmol/L咪唑； 50mmol/L TrisHCl； ， pH ⑨ 洗脫液： 300mmol/L咪唑； 50mmol/L TrisHCl； ， 轍窮配挽逛稈閘臍羨承討染滔傳禱乙纖宇濁戒澆涵塢竄翁袁隊(duì)訪焙觸融豎基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析 四． 實(shí)驗(yàn)儀器 X 50cm層析柱、自動分部收集器、紫外分光光度計(jì)、紫外檢測儀及記錄儀等。 啟沙梨瑯菱二況癱令想澄斟之暗碼具伸堤另酬蝕蜀閨珠酉漏掩倆主夠筒蟄基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá),純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋