dna重組及重組dna技術(shù)培訓(xùn)教材-資料下載頁
2025-01-08 02:14本頁面
【正文】 雙酶切 Eco RⅠ + Bg lⅡ雙酶切T4 DNA連接酶15186。C重組體目錄由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接 。 人工接頭 (linker)連接通過其他措施產(chǎn)生黏端進行連接目錄人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5180。3180。Eco RⅠEco RⅠEco RⅠEco RⅠ目錄在末端轉(zhuǎn)移酶 (terminal transferase) 的作用下，在 DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。 同聚物加尾連接目錄5180。3180。3180。5180。載體 DNA5180。3180。3180。5180。目的基因限制酶或機械剪切 限制酶 5180。3180。 3180。5180。 5180。 3180。 T(T)nT T(T)nT 3180。5180。 5180。 3180。 3180。5180。3180。 A(A)nA A(A)nA 3180。5180。λ核酸外切酶 λ核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶15186。C重組體5180。目錄PCR法216。 針對目的 DNA的 5?和 3?端，設(shè)計一對特異引物，在每條引物的 5?端分別加上不同的 RE位點，然后以目的 DNA為模板，經(jīng) PCR 擴增便可得到帶有引物序列的目的 DNA，再用相應(yīng) RE切割PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生黏端，隨后便可與帶有相同黏端的線性化載體進行有效連接。目錄 ?限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端?粘端補齊或切平形成的平端適用于：目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶15186。C重組體 載體自連 目的基因 自連目錄3. 粘 平末端連接n 黏 平末端連接是指目的 DNA和載體之間通過一端為黏端、另一端為平端的方式進行連接。 n 屬于定向克隆目錄216。受體菌條件：安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài) (petent) 216。導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染 (transfection)感染 (infection)（四）重組 DNA轉(zhuǎn)入受體細胞 —— 轉(zhuǎn)目錄1. 借助載體上的遺傳標志進行篩選 (1) 利用抗生素抗性標志篩選(2) 利用基因的插入失活 /插入表達 特性篩選(3) 利用標志補救篩選(4)利用噬菌體的包裝特性進行篩選（五）重組體的篩選與鑒定 —— 篩目錄2. 序列特異性篩選 (1) RE酶切法(2) PCR法 (3) 核酸雜交法(4) DNA測序法 3. 親和篩選法插入失活篩選帶有重組載體的克隆 α互補篩選（藍 白篩選） 菌落或噬斑原位雜交篩選重組體 目錄重組 DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為： 小結(jié)分 分離獲取目的基因 選 載體的選擇與構(gòu)建接 目的 DNA與載體連接 轉(zhuǎn) 重組 DNA轉(zhuǎn)入受體細胞篩 重組體的篩選與鑒定目錄重組 DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒 噬菌體 病毒目的基因（外源基因）基因組 DNA cDNA 人工合成 PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體 DNA 目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選 酶切電泳鑒定 菌落原位雜交目錄表達體系的建立：216。 表達載體的構(gòu)建216。 受體細胞的建立216。 表達產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達目錄216。 標準： 選擇標志 強啟動子 翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點216。 ：不宜表達真核基因組 DNA；不能加工表達的真核蛋白質(zhì)；表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) ；很難表達大量可溶性蛋白。1. 原核表達體系 ( )目錄216。 優(yōu)點： 可表達克隆的 cDNA及真核基因組 DNA 可適當修飾表達的蛋白質(zhì) 表達產(chǎn)物分區(qū)域積累216。 缺點： 操作技術(shù)難、費時、經(jīng)濟216。 轉(zhuǎn)染 —— 將表達載體導(dǎo)入真核細胞的過程方法： 磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射 （酵母、昆蟲、乳類動物細胞）目錄第三節(jié) 重組 DNA技術(shù)在醫(yī)學中的應(yīng)用Application of Rebinant DNA Technology in Medicine目錄一、重組 DNA技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物制藥216。利用基因工程生產(chǎn)有藥用價值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當今世界一項重大產(chǎn)業(yè)，并將有望成為 21世紀的支柱產(chǎn)業(yè)。 216。美國 Eli Lilly公司于 1982年首先利用重組DNA技術(shù)合成人胰島素并投放市場，標志著生物工程藥物時代的開始。迄今為止，已有50多種基因工程藥物上市，近千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成一個巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)生了不可估量的社會效益和經(jīng)濟效益。 重組 DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn) 品 功 能組織胞漿素原激活劑 抗凝血液因子 VIII 促進凝血顆粒細胞 巨噬細胞集落剌激因子 剌激白細胞生成促紅細胞生成素 剌激白細胞生成生長因子 (bFGF, EGF) 刺激細胞生長與分化生長素 治療侏儒癥胰島素 治療糖尿病干擾素 (? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素 激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶 抗組織損傷單克隆抗體 利用其結(jié)合特異性進行診斷試驗、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗 (CHO, 酵母 ) 預(yù)防乙肝口服重組 B亞單位菌體霍亂菌苗 預(yù)防霍亂目錄二、重組 DNA技術(shù)還應(yīng)用于醫(yī)學的其他諸多方面216。 疾病相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)與鑒定216。 轉(zhuǎn)基因和基因打靶216。 加速了人類基因組計劃的完成216。 疾病的基因診斷和基因治療 目錄演講完畢，謝謝觀看！
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