【正文】 入順序不是隨機的： DNA聚合酶一定要最后加入。 PCR儀設(shè)定的反應(yīng)條件： 94oC 45 S DNA變性 55 oC 45 S DNA復(fù)性 72 oC 1 min 產(chǎn)物鏈延伸 2530個循環(huán)后 72 oC 10 min 一般地，基因片段在 5001000bp左右時，可按下列條件進行 PCR： 介紹： PCR儀 如果上蓋加熱的 PCR儀，可以直接放入儀器中進行 PCR； 如果下面加熱的 PCR儀，加入 2滴礦物油后，加入儀器中，不過這種儀器現(xiàn)在已經(jīng)很少用到。 predenaturation 95℃ for 5min。 三、 PCR引物的設(shè)計 引物設(shè)計 的 基本原則 引物的設(shè)計實例 (＊ ) PCR 引物設(shè)計 的 基本原則 cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計。 引物長度（ primer length）常用的是 1827 bp。 3’端是 DNA延伸的起點，因此一定要嚴(yán)格與模板 DNA配對。 引物 3′端最好選擇 T？ 引物 3′端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異。 引物中四種堿基的分布最好是隨機的， 避免出現(xiàn)嘌呤，嘧啶的堆積現(xiàn)象 。 引物的 Tm值 （ melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下， 50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。 引物長度要確保 Tm值不低于 54176。 以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu) (Hairpin)。 引物間不應(yīng)存在互補序列。GTTGACTTGATA T 3180。 3180。 引入啟動子序列等。 但在后續(xù)的擴增循環(huán)中 ，這些與初始模板不配對的序列被帶到 PCR產(chǎn)物的雙鏈中去 ，所以如此引物參與的 PCR產(chǎn)物 ， 既含有目的擴增片段又含有兩側(cè)引入的核苷酸序列 。引物 3′ 端的△ G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā) DNA 聚合反應(yīng)。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。有的模板本身條件比較困難，例如 GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；用作克隆目的的 PCR，因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計的選擇自由度較低。 引物特異序列的長度至少為 1518bp。 引物上啟始和終止密碼：如果想表達(dá) DNA片段 ， 所 用的載體又不含啟始密碼和終止密碼 ， 應(yīng)將其設(shè)計在 引物的酶切位點之后 、 特異性 DNA序列之前 。 PCR反應(yīng)擴增的就是這一對引物之間的 DNA片段。也可以給定條件，讓軟件自動搜索引物，并將引物分析結(jié)果顯示出來。 四． PCR反應(yīng)注意事項 Optimization of PCR condition ＊ PCR方法操作簡便， 但影響因素頗多。 4)模板過多還能大量消耗鎂離子。 ? 但引物濃度太高， （ 1）會增大引物結(jié)合到不嚴(yán)格配對區(qū)域的機會，這樣的錯配會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的擴增 。 ?50 ?l反應(yīng)體系中加： ～ 1 ?l, 終濃度： ~ ?mol/L ?如果需要反復(fù)應(yīng)用的引物，配制后一定要分裝保存，一段時間后棄掉。 在 75~80℃ 具有最高的聚合酶活性。 抑制劑 : 乙醇、 DMSO、 DMF、甲酰胺、 SDS 等。 操作時先加水，最后加酶 （ ） Pfu DNA聚合酶 此酶耐熱性極好，在 ℃ 半衰期 3小時， 具有 3??5?外切酶活性， 催化 DNA合成的忠實性比 Taq DNA聚合酶高 12倍。 （ ） Tth DNA聚合酶 ? 半衰期： 95 0C， 20分鐘 ? 活 性： 具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，可簡化 RTPCR。 Mg 2+： 20~25mmol/L 3?l For Taq polymerase activity. 鎂離子濃度： ~ mmol/L Concentration: too Low: low activity too High: nonspecific amplification Taq DNA聚合酶活性需要 Mg2+。 ? Vary [Mg2+] in steps of mM Within ~ mM。 ? 在 PCR反應(yīng)中 ， dNTPs濃度在 20~200μmol/L。 1kb gene : 1 ?l。 熱啟動結(jié)束后暫停PCR反應(yīng)， 在 PCR儀上直接趁熱加入 DNA pol。 Half life of Taq DNA polymerase： 2h， 95oC 40mins， 97oC 5mins. 30 cycles will need 15 min ? 3）退火溫度和時間 PCR的基本流程： 94oC, 45 sec 55oC, 1 min 72oC, 2 min ? 退火溫度的變化是根據(jù)引物的 GC比例 、 引物的長度 調(diào)整的。 溫度： 72℃ ， 74℃ ，是 Taq 酶的最適工作溫度。 小于 500bp，一般采用 1分鐘即可； 500~2022bp: 2 min。 ? 4） 循環(huán)次數(shù) 總結(jié)： 其他因素 1）熱啟動：提高擴增的特異性 2）添加劑： DMSO消除引物與模板的二級結(jié)構(gòu)，降低 DNA的解鏈溫度，增進 DNA復(fù)性時的特異配對。 ③ 引物發(fā)生降解 : 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放 4 ℃ 導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。 變性不徹底： 變性溫度低，變性時間短。 手套、 離心管及槍頭 (質(zhì)量好） 等一次性使用 ,不要 碰到別處 。 ② PCR反應(yīng)液制備區(qū) 。 1) 引物特異性差 , 引物與靶序列不完全互補、或形成引物二聚體。 六、 PCR的應(yīng)用 ? 研究 基因克隆， DNA測序，分析突變 ? 診斷 細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷 ? 腫瘤 各種腫瘤檢測 ? 人類基因組工程 遺傳圖譜的構(gòu)建， DNA測序，表達(dá)圖譜 ? 法醫(yī) 犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析 ? 其他 …… 。 2) 模板或引物濃度過高 3) 酶量過多或質(zhì)量不好 4) Mg2+濃度偏高 5) 退火溫度偏低 6) 循環(huán)次數(shù)過多 原因 ? 非