實(shí)驗(yàn)十二dna連接與轉(zhuǎn)化(編輯修改稿)
2025-02-13 10:29 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 蓋上管蓋，充分混勻，臺(tái)式離心扣上離心５秒。 ? ３．１２ ℃ 下過(guò)夜連接反應(yīng)。 ? ４．反應(yīng)結(jié)束后于－２０ ℃ 保存。 四．結(jié)果與分析 ? 電泳檢查連接結(jié)果 ? １．如何判斷連接效果的成功性？ 問(wèn)題與討論： ? １．簡(jiǎn)述Ｔ４ＤＮＡ連接酶作用機(jī)理。 ? ２．簡(jiǎn)述一個(gè)完整外源ＤＮＡ的克隆過(guò)程。 ? ３．連接反應(yīng)中應(yīng)注意些什么問(wèn)題及如何提高連接效率。 2．ＤＮＡ的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選 ? 一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘? ? 體外通過(guò)基因工程手段所構(gòu)建的含目的基因的重組質(zhì)粒，選用轉(zhuǎn)化和篩選技術(shù)， 可獲得含重組的陽(yáng)性克隆。在此陽(yáng)性克隆中，ＤＮＡ可在生物體系中大量擴(kuò)增，繁殖， 保存以及表達(dá)目的基因的產(chǎn)物，這是ＰＣＲ體外擴(kuò)增ＤＮＡ所不能替代的。配合ＤＮＡ重組技術(shù)，所獲得的，不同目的需要的陽(yáng)性菌株已廣泛應(yīng)用于科研，醫(yī)藥生產(chǎn)和生物發(fā)酵等領(lǐng)域。 本實(shí)驗(yàn)由二個(gè)方面組成 : ? 1. 質(zhì)粒ＤＮＡ轉(zhuǎn)化大腸桿菌。 ? 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不同細(xì)菌有不同的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化效率的高低與實(shí)驗(yàn)的成敗直接相關(guān)， 通常轉(zhuǎn)化效率可達(dá)１０５－１０７轉(zhuǎn)化子 /μg DNA。 ? 獲得高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵是感受態(tài)體菌的制備。 ? 所謂感受態(tài)， 就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。 ? 關(guān)于感受態(tài)的本質(zhì)與存在，說(shuō)法很多， 目前主要有兩種假說(shuō)： １．局部原生質(zhì)體化假說(shuō)－－感受態(tài)細(xì)胞的表面形成一種能接受ＤＮＡ的酶位點(diǎn)， 使ＤＮＡ分子能進(jìn)入細(xì)胞。 制備感受態(tài)細(xì)胞 ? 現(xiàn)在制備感受態(tài)細(xì)胞通常用 CaCl2處理，在低溫中與外來(lái)ＤＮＡ分
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