dna印跡與雜交技術(shù)(編輯修改稿)
2025-06-03 18:05 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 預(yù)雜交：封閉膜上能與 DNA結(jié)合的位點 預(yù)雜交液為不含 DNA探針的雜交液 雜交：液相中的 DNA探針與膜上的待測 DNA雜交 雙鏈 DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交 洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的 DNA 6. 雜交結(jié)果的檢測 化學(xué)顯色或放射自顯影 標記的探針 探針 探針技能，它是指利用標記分子對其它分子的識別性而實現(xiàn)對后者進行檢測的一種技能，我們把標記的分子叫探針（ Probe） 從化學(xué)和生物學(xué)意義上理解，探針是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測的合適標記物，并與特異靶分子反應(yīng)。如抗體 抗體、外源凝集素 碳水合合物、親合素 生物素、受體 配基（ Ligand）以及互補核酸間的雜交均屬于探針 靶分子反應(yīng)。 （一）探針的種類 ? 基因組 DNA探針 ? cDNA探針 ? RNA探針 ? 寡核苷酸探針 （二）標記物 理想標記物應(yīng)具備的特性： ? 高度靈敏性 ? 不影響堿基配對的特異性 ? 不影響探針分子的主要理化性質(zhì) ? 對酶促反應(yīng)活性無影響或影響不大 ? 檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性 標記物種類 ? 核素標記物： 32p、 35s、 3H ? 非核素標記物 半抗原：生物素、地高率 配體：生物素是親和素的配體 熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等 化學(xué)發(fā)光探針：標記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光， 如生物素酰化的堿性磷酸酶 可使發(fā)光底物發(fā)光 （三）標記方法 體內(nèi)標記法： 將核素標記的化合物作為合成代謝的底物，在細胞合成代謝時使 核素摻入到新合成的核酸分子中，如 3H胸苷可摻入到 DNA中， 3H尿苷可摻入到 RNA中 體外標記法： 化學(xué)標記法：標記物分子上的活性基因與 探針分子上的某些基因反應(yīng)， 標記物直接結(jié)合到探針分子上 酶促標記法：標記物預(yù)先標記核苷酸，然 后利用酶促法將標記的核苷酸 摻入到探針上 酶促標記法 切口平移法（ nick translation) 利用 DNase I在 DNA雙鏈上造成單鏈切口 利用大腸桿菌 DNA聚合酶 I的 5??3?核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從 5?末端逐步切除 在 DNA聚合酶 I的 5??3?聚合酶催化下，以互補的 DNA單鏈為模板依次將 dNTP連接到切口的 3?末端 OH上，合成新的 DNA鏈，同時將標記的核苷酸摻入到新的 DNA鏈中 隨機引物法 其原理是隨機引物能與各種單鏈 DNA模板結(jié)合，作為合成新鏈的引物，在 DNA聚合酶的催化下，按 5??3?方向合成一新的 DNA鏈，其核苷酸序列與模板 DNA完全互補。另一單鏈 DNA模板同樣合成一條新的完全互補的 DNA鏈。合成時，帶放射性核素標記的核苷酸摻入到新合成的 DNA分子中 隨
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