[自然科學]雜交技術(shù)(編輯修改稿)
2024-11-12 22:54 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 確配對 ， 因此復性速度較慢 。 ③ 溫度： 溫度過高 ， 有利于 DNA變性而不利于復性；而 溫度過低 ， 碰撞機率減少 ， 易形成局部錯誤配對 ， 適宜的溫度是較 Tm值低 15℃ ～ 25℃ 。 ④ 離子強度： 離子強度過低 ， 不利于復性 ⑤ pH值： pH值在 5～ 9范圍內(nèi) ， 不影響復性速度 ， 過低或過高則影響 。 ⑥ DNA分子的復雜性： DNA總量一定時 ， 基因組越復雜 ， 其中特定順序的拷貝數(shù)就越少 ， 互補順序的濃度就越低 ， 因而復性反應速度越慢 。 （ 3） 雜交體系的建立要考慮以下幾因素 ① DNA濃度： DNA濃度越高 ， 復性速度越快 。 加入足夠的 DNA并盡量減少雜交的體積 ，一般以每平方厘米濾膜面積加 50～ 100μ l雜交液為宜 。 ② DNA探針的長度： 在雜交過程中 ， 待測 DNA固定在膜上 ， 只有探針可以自由擴散 ，探針越長 ， 擴散越慢 ， 變性越慢 。 因此探針的長度不宜過長 ， 一般以 10～ 50bp。 ③ 離子強度： 離子強度對變性影響較大 。一 般 常 用 5 或 6 SSC （ 1 SSC 為） 。 ④ 溫度： 溫度對于雜交 （ 復性 ） 反應的快慢和洗膜時去掉非特異雜交是至關(guān)重要的因素 。 一般認為雜交溫度為： 68℃ （ 不含甲酰胺 ） ；當含 50％ 甲酰胺時 ， 在 42℃ 進行雜交 。 洗膜溫度一般認為 55℃ ～ 65℃ 。 對于寡核苷酸探針的雜交溫度 ， 應根據(jù)下列公式推算： Tm=4℃ GC＋ 2℃ AT 雜交溫度一般比 Tm值低 5℃ ， 55℃ （ 20bp) ⑤ 雜交時間：一般應為 Cot1/2的 1～ 3倍 。 Yz 小時 /Cot1/2＝ 2 5 10X Co＝單鏈 DNA濃度 ， t1/2＝反應一半的時間 Y為探針 DNA的復雜性 ， 即片段大小 （ Kb） Z為雜交體系的體積 (ml)。 經(jīng)驗雜交時間 8～ 16h， 過夜 。 ⑥ 減少或抑制非特性雜交 。 一般在雜交前先進行 預雜交 ， 以便將非特異性 DNA位點封閉 ，同時也將膜上非特異性吸附位點封閉 。 ⑦ 促進雜交反應速度： 硫酸葡聚糖(dextran sulfate,Mw 500000)能促進 DNA鏈間的締合 ， 其微粒表面可吸附 DNA探針分子 ，從而使 DNA接觸面積增大 ， 有利于雜交反應 ，促進雜交反應速度 。 如 10％ 硫酸葡聚糖可使雜交反應速度提高 10～ 100倍 。 ① 預雜交： 將膜放在預雜液中 ， 即不放探針 ， 預雜交液中主要含 Dehardt液和鮭魚精 DNA， 主要是 封閉膜上非特異性的雜交位點 。 ② 雜交： 雜交液中除含封閉物質(zhì)外 ， 還含有 10％ 硫酸葡聚糖和探針 。 探針 如果是雙鏈 DNA， 則需要進行變性處理 。 溫度68℃ （ 不含甲酰胺 ） ， 42℃ （ 含 50％ 甲酰胺 ） ， 雜交時間： 8～ 16h過夜 。 （ 4） 雜交操作步驟 ③ 洗液： 將膜上未與 DNA雜交的及非特異性雜交的探針從膜上洗去的過程 。 由于非特異性雜交的雜交體穩(wěn)定性較低 ， 解鏈溫度較低 ， 而特異性雜交體由于穩(wěn)定而保留在濾膜上 。 注意， 洗膜液要換幾次， 要用幾種不同的洗膜液。 離子強度逐漸降低， 而 洗膜溫度逐漸上升（ 室溫～ 37℃ ～ 65℃ ）。即逐漸增加洗膜的強度。逐漸減少離子強度，為下一步反應（檢測）做好準備。 3．雜交信號的檢測 ⑴ 放射自顯影： 探針標記了放射性核素 ， 如 32P、 35S、 125I或 131I。 其具體方法是：在暗盒里將雜交后的濾膜放在 暗盒里的 X光片上 ， 蓋上暗盒 ，置－ 70℃ 曝光一定時間 。 經(jīng) 顯影 、 定影后 ， 可出現(xiàn)黑色曝光斑點 ，根據(jù) 斑點密度及大小 ， 判斷被檢測核酸是否有與探針相應序列及大小 。 ⑵ 顯色反應： 探針直接標記酶或間接結(jié)合酶，酶在有特異性底物存在的情況下，可發(fā)生顯色反應。 根據(jù)顯色反應斑點大小判斷結(jié)果。 A B C 酶 +底物 顯色 探針 標記物 (地高辛 ) 抗體 常用的酶 堿性磷酸酶 ： 作用底物： BCIP（ 5溴 4氯 4吲哚磷酸 ） NBT(硝基藍四氮唑 )。 顯色過程：堿性磷酸酶 → BCIP → 脫磷 ， 產(chǎn)生H+ → NBT還原 → 紫色化合物 。 辣根過氧化物酶 （ HRP） ： 常用的底物： DAB（ 二氨基聯(lián)苯胺 ） ， 紅棕色 ， 有致癌性 。TMB（
教學課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1