[自然科學(xué)]雜交技術(shù)-在線瀏覽
2024-12-03 22:54本頁(yè)面
【正文】 心 。 經(jīng)過(guò)了正電荷基團(tuán)修飾的 ， 又叫 特殊尼龍膜 。 ?經(jīng)短波紫外線照射后 ， 核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的帶正電荷的氨基相互交聯(lián) 。 ?堿處理 也可使核酸牢固地結(jié)合在尼龍膜上 ，特別適用于菌落原位印跡法 。 ?在低離子強(qiáng)度條件下 ， 也可與核酸牢固結(jié)合 ， 因此 適用于電轉(zhuǎn)印跡法 。 ⑵ 印跡方法 ① 斑點(diǎn)或狹縫印跡 ② 虹吸印跡法 ③ 電轉(zhuǎn)印跡法 ④ 真空轉(zhuǎn)移法 Southern印跡法 Northern印跡法 。 一般理想是 ～10Kb， 因片段大小直接影響轉(zhuǎn)移效率 。 分離 DNA片段 ， 與 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物比較（ Marker） , EB染色后觀察 DNA片段大小 Southern印跡法 (Nacl和 )室溫 1h， 其目的使 DNA變性 ， 即將雙鏈 DNA變成單鏈 DNA。 小于 15Kb， 轉(zhuǎn)移 1h。 不論采用哪種方法 ， 均是將DNA從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物上 ， 對(duì)于硝酸纖維膜 ， 可真空下 80℃ 烘烤2h(亦可無(wú)真空 )， 對(duì)尼龍膜還可用短波紫外線（ 波長(zhǎng) 254nm） 照射幾分鐘進(jìn)行固定 。 ?RNA的變性常與電泳同時(shí)進(jìn)行 ， 常有 3種方法 : ? 聚乙醛和二甲基亞砜變性電泳 ? 甲醛變性凝膠電泳 ? 甲基氧化汞電泳 Northern印跡法 ?RNA經(jīng)變性電泳后，一般可進(jìn)行轉(zhuǎn)移（印跡），其 印跡方法與 Southern方法相同 。 ?固定方法，常用 真空烘烤（ 80℃ ） 2h 2． 雜交（固－液相雜交）技術(shù) DNA分子雜交實(shí)際上是 雙鏈 DNA的變性和具有同源序列的兩條單鏈的復(fù)性過(guò)程 。 因此以 DNA分子雜交為例進(jìn)行介紹 。 方法有：加熱變性 有機(jī)溶劑變性 高濃度鹽變性 堿變性等 常用方法是 加熱變性和堿變性 。 ?熔解溫度（ melting temperature Tm值）當(dāng)增色效應(yīng) 達(dá)到最大值的 50%時(shí)溫度 ?Tm值表明 DNA溶液中 一半的 DNA雙鏈已解離為單鏈 ?Tm值反映了 DNA變性的程度和難易 ，Tm值越大，變性越難 ?大多數(shù) DNA的 Tm值在 85～ 90℃ 左右。 ③ pH值 ， pH值在 5～ 9之間范圍內(nèi) ， Tm值變化不明顯 ， 當(dāng) pH值大于 ， 所有氫鍵均被破壞 ， DNA完全變性 。 ④變性劑：變性劑可以干擾堿堆積力和氫鍵的形成，因此 可以降低 Tm值 。 通常用 50％的甲酰胺使 Tm值降低 30℃ （ 2）復(fù)性 單鏈核酸重新締合成雙鏈的過(guò)程。 ?復(fù)性則需要相對(duì) 較長(zhǎng)的時(shí)間 才能完成。 ?使變性 DNA完全恢復(fù)天然的雙鏈結(jié)構(gòu)，則要在 低于 Tm值 25℃ 的溫度下維持相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間 才能完成。 ② DNA的分子量： 大分子量的 DNA擴(kuò)散速度較慢 ， 碰撞機(jī)率較少 ， 同時(shí)又很難形成正確配對(duì) ， 因此復(fù)性速度較慢 。 ④ 離子強(qiáng)度： 離子強(qiáng)度過(guò)低 ， 不利于復(fù)性 ⑤ pH值： pH值在 5～ 9范圍內(nèi) ， 不影響復(fù)性速度 ， 過(guò)低或過(guò)高則影響 。 （ 3） 雜交體系的建立要考慮以下幾因素 ① DNA濃度： DNA濃度越高 ， 復(fù)性速度越快 。 ② DNA探針的長(zhǎng)度： 在雜交過(guò)程中 ， 待測(cè) DNA固定在膜上 ， 只有探針可以自由擴(kuò)散 ，探針越長(zhǎng) ， 擴(kuò)散越慢 ， 變性越慢 。 ③ 離子強(qiáng)度： 離子強(qiáng)度對(duì)變性影響較大 。 ④ 溫度： 溫度對(duì)于雜交 （ 復(fù)性 ） 反應(yīng)的快慢和洗膜時(shí)去掉非特異雜交是至關(guān)重要的因素 。 洗膜溫度一般認(rèn)為 55℃ ～ 65℃ 。 Yz 小時(shí) /Cot1/2＝ 2 5 10X Co＝單鏈 DNA濃度 ， t1/2＝反應(yīng)一半的時(shí)間 Y為探針 DNA的復(fù)雜性 ， 即片段大小 （ Kb） Z為雜交體系的體積 (ml)。 ⑥ 減少或抑制非特性雜交 。 ⑦ 促進(jìn)雜交反應(yīng)速度： 硫酸葡聚糖(dextran sulfate,Mw 500000)能促進(jìn) DNA鏈間的締合 ， 其微粒表面可吸附 DNA探針分子 ，從而使 DNA接觸面積增大 ， 有利于雜交反應(yīng) ，促進(jìn)雜交反應(yīng)速度 。 ① 預(yù)雜交： 將膜放在預(yù)雜液中 ， 即不放探針 ， 預(yù)雜交液中主要含 Dehardt液和鮭魚精 DNA， 主要是 封閉膜上非特異性的雜交位點(diǎn) 。 探針 如果是雙鏈 DNA， 則需要進(jìn)行變性處理 。 （ 4） 雜交操作步驟 ③ 洗液： 將膜上未與 DNA雜交的及非特異性雜交的探針從膜上洗去的過(guò)程 。 注意， 洗膜液要換幾次， 要用幾種不同的洗膜液。即逐漸增加洗膜的強(qiáng)度。 3．雜交信號(hào)的檢測(cè)
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