[自然科學(xué)]雜交技術(shù)-文庫(kù)吧資料
2024-10-22 22:54本頁(yè)面
【正文】 的抗體 發(fā)生特異性的抗原抗體結(jié)合反應(yīng) ?與 酶或同位素標(biāo)記的第二抗體 發(fā)生反應(yīng) ?經(jīng)過(guò)底物 顯色或放射自顯影 ， 以檢測(cè)電泳分離的靶蛋白 。 化學(xué)發(fā)光 是一種有發(fā)展前途的檢測(cè)方法 。 ⑶ 化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 與顯色反應(yīng)基本一致 ， 只是酶 （ HRP堿性磷酸酶 ） 催化一種特殊底物如 luminol、CSPD等 ， 產(chǎn)生發(fā)光 ， 而不顯色 。 辣根過(guò)氧化物酶 （ HRP） ： 常用的底物： DAB（ 二氨基聯(lián)苯胺 ） ， 紅棕色 ， 有致癌性 。 A B C 酶 +底物 顯色 探針 標(biāo)記物 (地高辛 ) 抗體 常用的酶 堿性磷酸酶 ： 作用底物： BCIP（ 5溴 4氯 4吲哚磷酸 ） NBT(硝基藍(lán)四氮唑 )。 ⑵ 顯色反應(yīng)： 探針直接標(biāo)記酶或間接結(jié)合酶，酶在有特異性底物存在的情況下，可發(fā)生顯色反應(yīng)。 其具體方法是：在暗盒里將雜交后的濾膜放在 暗盒里的 X光片上 ， 蓋上暗盒 ，置－ 70℃ 曝光一定時(shí)間 。逐漸減少離子強(qiáng)度，為下一步反應(yīng)（檢測(cè)）做好準(zhǔn)備。 離子強(qiáng)度逐漸降低， 而 洗膜溫度逐漸上升（ 室溫～ 37℃ ～ 65℃ ）。 由于非特異性雜交的雜交體穩(wěn)定性較低 ， 解鏈溫度較低 ， 而特異性雜交體由于穩(wěn)定而保留在濾膜上 。 溫度68℃ （ 不含甲酰胺 ） ， 42℃ （ 含 50％ 甲酰胺 ） ， 雜交時(shí)間： 8～ 16h過(guò)夜 。 ② 雜交： 雜交液中除含封閉物質(zhì)外 ， 還含有 10％ 硫酸葡聚糖和探針 。 如 10％ 硫酸葡聚糖可使雜交反應(yīng)速度提高 10～ 100倍 。 一般在雜交前先進(jìn)行 預(yù)雜交 ， 以便將非特異性 DNA位點(diǎn)封閉 ，同時(shí)也將膜上非特異性吸附位點(diǎn)封閉 。 經(jīng)驗(yàn)雜交時(shí)間 8～ 16h， 過(guò)夜 。 對(duì)于寡核苷酸探針的雜交溫度 ， 應(yīng)根據(jù)下列公式推算： Tm=4℃ GC＋ 2℃ AT 雜交溫度一般比 Tm值低 5℃ ， 55℃ （ 20bp) ⑤ 雜交時(shí)間：一般應(yīng)為 Cot1/2的 1～ 3倍 。 一般認(rèn)為雜交溫度為： 68℃ （ 不含甲酰胺 ） ；當(dāng)含 50％ 甲酰胺時(shí) ， 在 42℃ 進(jìn)行雜交 。一 般 常 用 5 或 6 SSC （ 1 SSC 為） 。 因此探針的長(zhǎng)度不宜過(guò)長(zhǎng) ， 一般以 10～ 50bp。 加入足夠的 DNA并盡量減少雜交的體積 ，一般以每平方厘米濾膜面積加 50～ 100μ l雜交液為宜 。 ⑥ DNA分子的復(fù)雜性： DNA總量一定時(shí) ， 基因組越復(fù)雜 ， 其中特定順序的拷貝數(shù)就越少 ， 互補(bǔ)順序的濃度就越低 ， 因而復(fù)性反應(yīng)速度越慢 。 ③ 溫度： 溫度過(guò)高 ， 有利于 DNA變性而不利于復(fù)性；而 溫度過(guò)低 ， 碰撞機(jī)率減少 ， 易形成局部錯(cuò)誤配對(duì) ， 適宜的溫度是較 Tm值低 15℃ ～ 25℃ 。 復(fù)性的 （ 速度 ） 過(guò)程的影響因素 ： ① DNA的濃度： DNA濃度越大 、 碰撞機(jī)率越大 ， 復(fù)性速度越快 。 分子碰撞機(jī)率越大 ，復(fù)性速度越快，一開(kāi)始往往錯(cuò)誤碰撞，只有正確配對(duì)才是復(fù)性的開(kāi)始 。 ?復(fù)性的過(guò)程是 相當(dāng)復(fù)雜的 。常用的變性劑是甲酰胺和脲。 這就是堿變性的原理 。 Tm值的影響因素： ① DNA的堿基組成 ， Tm值主要受 G： C堿基對(duì)數(shù)量多少的影響 ， 有一個(gè)經(jīng)驗(yàn)公式為： Tm＝ (G+C)% ＋ ② 溶液的離子強(qiáng)度 ， DNA鏈上的磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷，在無(wú)鹽的水中， DNA在室溫條件下就會(huì)變性，而 加入鹽后 ，正電荷離子可以封閉磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷，使 DNA雙鏈的穩(wěn)定性增加， Tm值亦會(huì)升高。 ?DNA變性時(shí)，在 260nm處的紫外吸光度增加，這種現(xiàn)象又稱 增色效應(yīng) 。 （ 1） 變性 即打開(kāi) DNA雙螺旋結(jié)構(gòu) ， 變成單鏈 DNA的過(guò)程 。 RNA分子雜交也涉及變性 和復(fù)性過(guò)程（ 這種變性是單鏈 RNA分子內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)過(guò)程 ） 。 ?對(duì)含甲醛的凝膠，可用 DEPC預(yù)處理水漂洗，以去除甲醛 。 ?基本原理 與 Southern印跡相同 ?但 RNA變性方法與 DNA不同 : 不能用堿變性 ，因?yàn)閴A導(dǎo)致 RNA水解 。 (轉(zhuǎn)移 )方法：虹吸印跡法 ， 電轉(zhuǎn)印跡法和真空印跡法 。 如果 DNA片段較大 (大于 15kb)， 可在變性前 ， 用稀鹽酸（ ） 處理 10min,因?yàn)槠蔚拇笮≈苯佑绊戅D(zhuǎn)移率速 。 。 酶切變成合適長(zhǎng)度的 DNA片段 。 ?缺點(diǎn)：由于結(jié)合力強(qiáng) ， 非特異性吸附較多 ， 雜交信號(hào)本底較高 ， 應(yīng)注意封閉 。 ?尼龍膜 質(zhì)地堅(jiān)韌 ， 不易損壞 ， 操作方便 ，可 進(jìn)行多次重復(fù)雜交 。 因此特別適用于小分子核酸片段的雜交 。 ?特殊尼龍膜帶有正電荷 ， 對(duì)核酸的結(jié)合力 要比硝酸纖維素膜強(qiáng)好多倍 。
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