[自然科學(xué)]雜交技術(shù)-資料下載頁(yè)
2024-10-16 22:54本頁(yè)面
【正文】 ?蛋白質(zhì)分子的 遷移速率完全取決于分子量的大小 ， 從而達(dá)到了分離不同分子量大小蛋白質(zhì)的目的 （二） SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 ?膠有效分離范圍 取決于用于灌膠的聚丙烯酰胺的 濃度和交聯(lián)度 。 ?經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián)后丙烯酰胺凝膠的剛性和抗張強(qiáng)度都有所增加 ， 形成的 小孔必須能夠允許 SDS蛋白復(fù)合物通過 ?這些小孔的孔徑隨雙丙烯酰胺 、 丙烯酰胺比率的增加而變小 ， 比率接近 1:20時(shí)孔徑達(dá)到最小值 。 一般按雙丙稀酰胺 、丙烯酰胺為 1:29配制 表 1 SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍 丙烯酰胺濃度（％） 線性分離范圍（ kD） 15 12～ 43 10 16～ 68 36～ 94 5 57～ 212 1． SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制 （ 1） 安裝玻璃板 （ 2）確定凝膠溶液體積，按所需丙烯酰胺濃度配制一定體積的分離膠溶液 。 依次混合各成分（見下表） 一旦加入 TEMED，馬上開始聚合 ，故應(yīng)立即快速旋動(dòng)混合物并進(jìn)入下步操作 表 2 積層膠、分離膠所需溶液成分的配比 溶液成分（ ml） 5%積層膠 不同濃度的分離膠 6% 8% 10% 12% 15% 水 30%丙稀酰胺 Tris() － Tris() － － － － － 10%SDS 10%過硫酸胺 TEMED 總體積（ ml） 5 10 10 10 10 10 （ 3）迅速在兩板的間隙 灌注丙烯酰胺溶液，留出積層膠所需空間 （梳子的齒長(zhǎng)再加 1cm）。然后小心的在丙烯酰胺溶液上 加一層去離子水 。凝膠垂直放置于室溫下。 （ 4）分離膠聚合完全后（約 30min），傾斜倒出覆蓋的去離子水。 （ 5）配制 5%積層膠 。 （ 6）在已聚合的分離膠上直接 灌注積層膠 ，立即在積層膠溶液中 插入干凈的梳子。小心避免混入氣泡。 （ 7）積層膠聚合完全后（約 30min），小心移出梳子。將凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽各加入 Tris甘氨酸電泳緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部?jī)刹ＡО逯g的氣泡。 2． 上樣和電泳 ? 取一定量樣品 與上樣緩沖液混合 后 ， 加入上樣孔 。 ?將電泳槽與電源連接 （ 正極應(yīng)接下槽 ） ，凝膠上所加的電壓為 8伏 /cm。 當(dāng)上樣緩沖液中的 染料前沿進(jìn)入分離膠后 ， 把電壓提高到15伏 /cm， 繼續(xù)電泳直至 溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部 （ 約 4h） ， 然后關(guān)閉電源 。 ?從電泳裝置上卸下玻璃板 ， 用刮勺撬開玻璃板 ， 取下凝膠 。 3． 考馬斯亮藍(lán)對(duì) SDS凝膠進(jìn)行染色 考馬斯亮藍(lán)染色的主要目的包括： ① 顯示靶蛋白在凝膠中的粗略位置 ， 從而切去不含靶蛋白的凝膠 ， 這樣可以節(jié)省硝酸纖維素膜； ② 轉(zhuǎn)膜后 ， 凝膠染色可 判斷蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜是否完全 。 Western印跡的固相支持體有多種： 重氮苯硫醚 （ diazophenylthio, DPT） 紙 重氮芐氧甲基 （ diazobenzyloxymethyl, DBM） 紙 溴化氰活化紙 氰尿酰氯紙 活化尼龍膜 目前最常用的是 硝酸纖維素濾膜 （三）蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持體 蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上： ?凝膠及與之相貼的硝酸纖維素濾膜 夾于事先用轉(zhuǎn)膜緩沖液 浸泡過的 Whatman 3MM濾紙 之間 ?然后把結(jié)合體夾在石墨電極板之間 ， 硝酸纖維素濾膜朝陽(yáng)極 一側(cè) ?蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移可用于 室溫 進(jìn)行 ， ～ 2h便可完成 。 對(duì)硝酸纖維素膜上的蛋白進(jìn)行染色 判斷轉(zhuǎn)膜是否完全 可供硝酸纖維素濾膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色的方法有很多種 ， 但 只有麗春紅 S染色法可與免疫學(xué)檢測(cè)方法兼容 ， 這是因?yàn)樵撊玖现粫?huì)短暫顯色而且在進(jìn)行 Western印跡時(shí)被洗去 。 1．封閉濾膜的蛋白結(jié)合位點(diǎn)：在加入一抗之前， 必須封閉可能結(jié)合的位點(diǎn) 以降低這類非特異性結(jié)合的背景。 ?封閉液常用 脫脂奶粉 ?將硝酸纖維素濾膜放入自封袋中，根據(jù)濾膜面積以 ?盡可能 排除里面的氣泡 ，然后封閉袋口，平放在平緩的 搖床平臺(tái)上室溫溫育 1h～ 2h ?PBS漂洗濾膜 3次 ，每次 10min。 （四）抗原抗體反應(yīng) 2．第一抗體和靶蛋白的結(jié)合 將抗體以適當(dāng)?shù)?比例稀釋 室溫反應(yīng) 1h～ 2h PBS漂洗 濾膜 3次，每次 10min 3．加入第二抗體 加入適當(dāng) 稀釋的二抗 室溫反應(yīng) 1h～ 2h PBS漂洗 濾膜 3次，每次 10min 4． 顯色 第二抗體通常是抗免疫球蛋白抗體或 A蛋白 ?可用 125I進(jìn)行放射性標(biāo)記 ?也可與 辣根過氧化物酶 共價(jià)偶聯(lián) ?與 堿性磷酸酶 共價(jià)偶聯(lián) 由于 放射性標(biāo)記過程有時(shí)可導(dǎo)致抗體失活 ，因此更傾向于使用酶聯(lián)標(biāo)記的抗體 。 謝 謝
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