[自然科學(xué)]雜交技術(shù)(已改無錯字)
2022-11-16 22:54:44 本頁面
【正文】 四甲基聯(lián)苯胺 ） ， 產(chǎn)生藍(lán)色 ， 無致癌性 。 ⑶ 化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 與顯色反應(yīng)基本一致 ， 只是酶 （ HRP堿性磷酸酶 ） 催化一種特殊底物如 luminol、CSPD等 ， 產(chǎn)生發(fā)光 ， 而不顯色 。 該化學(xué)光可使 X光片曝光 ， 經(jīng)顯影 、 定影后 ， 可獲得雜交斑點 。 化學(xué)發(fā)光 是一種有發(fā)展前途的檢測方法 。如需準(zhǔn)確定性和定量 ， 可用數(shù)字成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測 。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)雜交技術(shù) ?檢測 DNA可用 Southern印跡法 ?檢測 RNA可用 Northern印跡法 ?檢測蛋白質(zhì)同樣有蛋白質(zhì)印跡法（ Western印跡法 ） ?蛋白質(zhì)印跡是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相支持物上 ， 然后利用抗體與附著于固相支持物上的靶蛋白發(fā)生 特異性的抗原抗體結(jié)合反應(yīng) ?待測樣品經(jīng)過 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE） ?被 轉(zhuǎn)移到固相支持物上 ， 固相支持物以非共價鍵的形式吸附蛋白質(zhì) ?以固相支持物上的蛋白質(zhì)為抗原 ， 與對應(yīng)的抗體 發(fā)生特異性的抗原抗體結(jié)合反應(yīng) ?與 酶或同位素標(biāo)記的第二抗體 發(fā)生反應(yīng) ?經(jīng)過底物 顯色或放射自顯影 ， 以檢測電泳分離的靶蛋白 。 一、原理 ?Western印跡有 SDSPAGE的高分辨力 ?固相 免疫測定的高特異性和敏感性 ， 可測出 1ng～ 5ng中等大小的蛋白質(zhì) 。 ?由于蛋白質(zhì)的 電泳分離 幾乎總是在 變性的條件下進(jìn)行 ， 因此 ， 不存在溶解 、 聚集以及靶蛋白與外來蛋白的共沉淀等問題 。 ?還具有 簡便 、 標(biāo)本可長期保存 、 結(jié)果便于比較等優(yōu)點 。 （一）蛋白提取試劑 1．細(xì)胞裂解液 20mmol/L Tris(pH ) 150mmol/L NaCl 1% Triton X100 焦磷酸鈉， β磷酸甘油， EDTA，正釩酸鈉(Na3VO4)亮抑肽素等 多種蛋白酶抑制劑 二、試劑 2 蛋白 上樣緩沖液 100mmol/L TrisCl(pH ) 200mmol/L二硫蘇糖醇（ DTT） 4% SDS(十二烷基硫酸鈉 ) % 溴酚藍(lán) 20%甘油 （二） SDSPAGE試劑 1． 30%丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺 30g、雙丙烯酰胺 ，溶于 100ml水中，過濾后貯于褐色瓶中低溫保存，可用一個月。 2． Tris緩沖液 （ 1） ()/積層膠緩沖液：Tris堿 ，用 HCl調(diào) ，加水至100ml。 （ 2） ()分離膠緩沖液：Tris堿 ，用 HCl調(diào) ，加水至100ml。 3． 10% SDS 可用去離子水配成貯存液保存于室溫。 4． 10%過硫酸胺 ?過硫酸胺提供丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的 自由基 。 ?可用去離子水配制小量的貯存液并保存于 4℃ 冰箱中 。 ?由于過硫酸胺會緩慢分解，故應(yīng) 隔周重新配制 。 5． TEMED（ N,N,N′,N′－四甲基乙二胺） 通過 催化過硫酸胺形成自由基 而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。 6． Tris甘氨酸電泳緩沖液 ?配成 10 貯存液備用，在 900ml去離子水中溶解 30g Tris堿和 144g甘氨酸，然后加入10g SDS，用 HCl調(diào) pH至 ，用去離子水補(bǔ)至 1000ml。 ?使用前用 去離子水稀釋成 1 應(yīng)用液 。 （三）轉(zhuǎn)膜緩沖液 39mmol/L 甘氨酸 48mmol/L Tris堿 % SDS 20% 甲醇 （四）染色液與脫色液 1． 考馬斯亮藍(lán) R250染液 100mg考馬斯亮藍(lán) R250溶于 40ml 乙醇，加 10ml冰醋酸，補(bǔ)水至 100ml。 2． 考馬斯亮藍(lán)脫色液 40ml 乙醇，加 10ml冰醋酸，補(bǔ)水至 100ml。 3． 麗春紅 S貯存液 2g麗春紅 S， 30g三氯乙酸， 30g磺基水楊酸，加水至 100ml。 使用時，將 1份上述貯存液加 9份去離子水即為麗春紅 S應(yīng)用液，使用后應(yīng)廢棄。 （五）封閉液 5％脫脂奶粉 % 防沫劑 A %疊氮鈉 溶于磷酸鹽緩沖液（ PBS） （一）樣品前處理 ?細(xì)菌 一般直接用蛋白上樣緩沖液裂解； ?真核細(xì)胞或哺乳動物組織通常 加細(xì)胞裂解液，機(jī)械或超聲波 室溫勻漿 ～ 1min。 ?4℃ 10,000g～ 13,000g離心 5min， 取上清 ?按照每 4μl蛋白樣品加入 1μl 5 蛋白上樣緩沖液的比例混合。 100℃ 水浴加熱 3min～5min，以充分 變性蛋白 。 ?冷卻到室溫， 上樣到 SDSPAGE膠加樣孔 三、實驗方法 ?原理是根據(jù)大多數(shù)蛋白質(zhì)都能與陽離子表面活性劑 SDS按重量比結(jié)合成復(fù)合物 ?使 蛋白質(zhì)復(fù)合物所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過天然蛋白質(zhì)分子所帶的負(fù)電荷 ， 消除了不同蛋白質(zhì)分子的電荷效應(yīng)
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