[自然科學]雜交技術(shù)-wenkub.com
2024-10-13 22:54 本頁面
【正文】 ?封閉液常用 脫脂奶粉 ?將硝酸纖維素濾膜放入自封袋中，根據(jù)濾膜面積以 ?盡可能 排除里面的氣泡 ，然后封閉袋口，平放在平緩的 搖床平臺上室溫溫育 1h～ 2h ?PBS漂洗濾膜 3次 ，每次 10min。 3． 考馬斯亮藍對 SDS凝膠進行染色 考馬斯亮藍染色的主要目的包括： ① 顯示靶蛋白在凝膠中的粗略位置 ， 從而切去不含靶蛋白的凝膠 ， 這樣可以節(jié)省硝酸纖維素膜； ② 轉(zhuǎn)膜后 ， 凝膠染色可 判斷蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜是否完全 。 2． 上樣和電泳 ? 取一定量樣品 與上樣緩沖液混合 后 ， 加入上樣孔 。小心避免混入氣泡。凝膠垂直放置于室溫下。 ?經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián)后丙烯酰胺凝膠的剛性和抗張強度都有所增加 ， 形成的 小孔必須能夠允許 SDS蛋白復(fù)合物通過 ?這些小孔的孔徑隨雙丙烯酰胺 、 丙烯酰胺比率的增加而變小 ， 比率接近 1:20時孔徑達到最小值 。 （五）封閉液 5％脫脂奶粉 % 防沫劑 A %疊氮鈉 溶于磷酸鹽緩沖液（ PBS） （一）樣品前處理 ?細菌 一般直接用蛋白上樣緩沖液裂解； ?真核細胞或哺乳動物組織通常 加細胞裂解液，機械或超聲波 室溫勻漿 ～ 1min。 （三）轉(zhuǎn)膜緩沖液 39mmol/L 甘氨酸 48mmol/L Tris堿 % SDS 20% 甲醇 （四）染色液與脫色液 1． 考馬斯亮藍 R250染液 100mg考馬斯亮藍 R250溶于 40ml 乙醇，加 10ml冰醋酸，補水至 100ml。 ?由于過硫酸胺會緩慢分解，故應(yīng) 隔周重新配制 。 （ 2） ()分離膠緩沖液：Tris堿 ，用 HCl調(diào) ，加水至100ml。 ?還具有 簡便 、 標本可長期保存 、 結(jié)果便于比較等優(yōu)點 。如需準確定性和定量 ， 可用數(shù)字成像系統(tǒng)進行檢測 。TMB（ 四甲基聯(lián)苯胺 ） ， 產(chǎn)生藍色 ， 無致癌性 。 根據(jù)顯色反應(yīng)斑點大小判斷結(jié)果。 3．雜交信號的檢測 ⑴ 放射自顯影： 探針標記了放射性核素 ， 如 32P、 35S、 125I或 131I。 注意， 洗膜液要換幾次， 要用幾種不同的洗膜液。 探針 如果是雙鏈 DNA， 則需要進行變性處理 。 ⑦ 促進雜交反應(yīng)速度： 硫酸葡聚糖(dextran sulfate,Mw 500000)能促進 DNA鏈間的締合 ， 其微粒表面可吸附 DNA探針分子 ，從而使 DNA接觸面積增大 ， 有利于雜交反應(yīng) ，促進雜交反應(yīng)速度 。 Yz 小時 /Cot1/2＝ 2 5 10X Co＝單鏈 DNA濃度 ， t1/2＝反應(yīng)一半的時間 Y為探針 DNA的復(fù)雜性 ， 即片段大小 （ Kb） Z為雜交體系的體積 (ml)。 ④ 溫度： 溫度對于雜交 （ 復(fù)性 ） 反應(yīng)的快慢和洗膜時去掉非特異雜交是至關(guān)重要的因素 。 ② DNA探針的長度： 在雜交過程中 ， 待測 DNA固定在膜上 ， 只有探針可以自由擴散 ，探針越長 ， 擴散越慢 ， 變性越慢 。 ④ 離子強度： 離子強度過低 ， 不利于復(fù)性 ⑤ pH值： pH值在 5～ 9范圍內(nèi) ， 不影響復(fù)性速度 ， 過低或過高則影響 。 ?使變性 DNA完全恢復(fù)天然的雙鏈結(jié)構(gòu)，則要在 低于 Tm值 25℃ 的溫度下維持相當長的時間 才能完成。 通常用 50％的甲酰胺使 Tm值降低 30℃ （ 2）復(fù)性 單鏈核酸重新締合成雙鏈的過程。 ③ pH值 ， pH值在 5～ 9之間范圍內(nèi) ， Tm值變化不明顯 ， 當 pH值大于 ， 所有氫鍵均被破壞 ， DNA完全變性 。 方法有：加熱變性 有機溶劑變性 高濃度鹽變性 堿變性等 常用方法是 加熱變性和堿變性 。 ?固定方法，常用 真空烘烤（ 80℃ ） 2h 2． 雜交（固－液相雜交）技術(shù) DNA分子雜交實際上是 雙鏈 DNA的變性和具有同源序列的兩條單鏈的復(fù)性過程 。 不論采用哪種方法 ， 均是將DNA從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物上 ， 對于硝酸纖維膜 ， 可真空下 80℃ 烘烤2h(亦可無真空 )， 對尼龍膜還可用短波紫外線（ 波長 254nm） 照射幾分鐘進行固定 。 分離 DNA片段 ， 與 DNA分子量標準參照物比較（ Marker） , EB染色后觀察 DNA片段大小 Southern印跡法 (Nacl和 )室溫 1h， 其目的使 DNA變性 ， 即將雙鏈 DNA變成單鏈 DNA。 ⑵ 印跡方法 ① 斑點或狹縫印跡 ② 虹吸印跡法 ③ 電轉(zhuǎn)
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