[自然科學(xué)]免疫學(xué)試驗(yàn)技術(shù)-文庫吧資料
2025-02-26 05:20本頁面
【正文】 ? 免疫組化法： 應(yīng)用酶標(biāo)抗體對生物組織中的抗原進(jìn)行鑒定和定位 ， 稱為免疫組化法 。 (6) 將上述液裝入透析袋中，對 PBS透析，4℃ 過夜。 (4) 加 20μl 碳酸鹽緩沖液，使以上醛化的 RP的 PH升高到 ～ ，然后立即加入 10mg IgG(抗體 )在 1ml ，室溫避光輕輕攪拌 2小時(shí)。 (2) 于上液中加入 NaIO４溶液，室溫下避光攪拌 20分鐘。僅適用于含糖蛋白分子的酶（如 HRP）標(biāo)記物制備。如 戊二醛交聯(lián)法 。 辣根過氧化物酶（ HRP）常用的底物： 鄰苯二胺（ OPD）： 反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性 四甲基聯(lián)苯胺（ TMB）： 反應(yīng)后呈藍(lán)色，無需避光，無致癌性，但水溶性差。 ? ２、 酶標(biāo)抗體的制備 ? 用于標(biāo)記的抗體要求高純高、高效價(jià)、與抗原的結(jié)合力強(qiáng)，以提取的 IgG最為理想。 ? １、原理： 能與被檢抗原形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，免疫復(fù)合物上的酶在遇到相應(yīng)的底物時(shí)，催化無色的底物，生成可溶性或不溶性的有色產(chǎn)物。 ? 對照： ? 需用正常血清處理作為對照，此對照片應(yīng)無熒光。 ? 間接法 ? 制片：同直接法 ? 染色： 染色時(shí) ， 標(biāo)本先滴加抗血清 ， 在37℃ 處理 30～ 60min； ? 用 PBS充分洗滌后 ， 再用熒光標(biāo)記的抗抗體染色 ， 37℃ 30～ 60min， 洗滌 ， 封固 。 ? 鏡檢： ? 在熒光顯微鏡下進(jìn)行檢查，抗原所在部位呈黃綠色熒光。 ? 應(yīng)用 主要用于檢測抗原 （定性、定位） 特點(diǎn)：敏感，需熒光 顯微鏡 直接法： 病料（ Ag） 涂片（切片） FAbAg 鏡檢 間接法： 病料（ Ag） 涂片 AgAb1 Ag Ab1Ab2 F 鏡檢 FAb Ab1 Ab2F 直接法 檢測一種抗原就須標(biāo)記一種特異性的 AbF ，較特異 間接法 標(biāo)記一種動物的免疫球蛋白 AbF，就能檢測多種抗原，較敏感 ? 直接法 ? 制片： ? 待檢病理組織做成冰凍切片或觸片，細(xì)菌材料可做成涂片，在室溫中自然干燥，病毒抗原通常用冷丙酮固定 l5min，細(xì)菌抗原則用加熱固定即可。 一般以低溫標(biāo)記為最好。 ? ④避光以電磁攪拌器攪拌，其反應(yīng)時(shí)間與溫度有關(guān)。應(yīng)用 FITC進(jìn)行溶解。 ? （２）熒光抗體的標(biāo)記： 標(biāo)記 Ab常用的熒光素有 異硫氰酸熒光素 （ FITC，為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，最大吸收光波長為 490495nm，最大發(fā)射光波長 520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光 ）和 四乙基羅丹明 （ RB200，為橘紅色粉末，最大吸收光波長為 570nm，最大發(fā)射光波長為 595－ 600nm，呈橘紅色熒光 ）。 ? 熒光抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合后，（ 1）通過熒光顯微鏡觀察可測知抗原的存在及部位； （ 2）依熒光強(qiáng)弱也可測知抗原量的差異。 ? 檢測系統(tǒng) Ag + Ab AgAb AgAb補(bǔ)體 + 補(bǔ)體 紅細(xì)胞 + 溶血素 紅 溶 指示系統(tǒng) （不溶血，陽性） 紅 溶 補(bǔ)體 （溶血，陰性） 4. 標(biāo)記抗體技術(shù) 標(biāo)記抗體技術(shù)是在抗體球蛋白分子上，連接某一個(gè)特定的、容易檢測的分子或原子 (標(biāo)記物 )，利用標(biāo)記抗體能與相應(yīng)抗原結(jié)合的特性，通過標(biāo)記物的檢測，從而確定抗原的存在部位。 在 Ag、 Ab在凝膠中擴(kuò)散的同時(shí)加入電場作用，使 Ag、 Ab的擴(kuò)散速度加快，同時(shí)限制了擴(kuò)散的方向，增加了試驗(yàn)的敏感性。 ? 沉淀抗原是細(xì)胞的浸出成分，為細(xì)微的膠體溶液，單個(gè)抗原的體積小而總面積大，出現(xiàn)反應(yīng)需要的抗體量多 ? 沉淀試驗(yàn)可分為 環(huán)狀 /絮狀沉淀試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳。 ? 可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合所發(fā)生的沉淀反應(yīng) (precipitation)。 橋梁凝集試驗(yàn) 又稱 Coombs抗球蛋白試驗(yàn)，用于檢測不完全抗體。 ? SPA協(xié)同凝集試驗(yàn) 葡萄球菌 A蛋白（
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