[自然科學(xué)]免疫學(xué)試驗(yàn)技術(shù)(存儲(chǔ)版)
【正文】 抗體，免疫過程要麻醉動(dòng)物。每次注射強(qiáng)毒、 Ag間隔時(shí)間為 57天。 劑型： 油包水型、 水包油型 水相（ Ag） 油相 油相 水相 常用的油性佐劑有： A、白油佐劑 油相： 94%白油、 6%司本 80（去水山梨醇單油酸酯）、 2%硬脂酸鋁，加熱、融化、高壓滅菌。 這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn) ， 應(yīng)根據(jù)抗體的特點(diǎn) 、 純度要求和實(shí)驗(yàn)室具體條件加以選擇 。 IgG ， IgM， IgA的等電點(diǎn)分別為 pH 、 、 。 ? 洗脫一般采用改變 pH值的方法 使用前 樣品結(jié)合 (Binding) 洗脫 (Elution) ?血清 硫酸銨沉淀 透析 過 凝膠過濾柱 過 DEAE纖 維素柱 IgG 。 ? 蛋白質(zhì)的電荷狀態(tài)可以隨著緩沖液 pH的改變而改變，當(dāng) pH7以上時(shí)，大多蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，而 DEAE纖維素帶正電荷，當(dāng)血清通過 DEAE纖維素柱時(shí)，蛋白質(zhì)即借靜電吸附在纖維素柱上。 在大多數(shù)情況下 ， 免疫血清 、 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清以及腹水中的抗體需經(jīng)純化后再用于各種免疫學(xué)檢測中去 。 ? ② 油乳佐劑： 油水不溶，但在乳化劑存在的情況下，高速攪拌可使二者形成乳劑而制成的佐劑。 ? ? ② 強(qiáng)化免疫： 基礎(chǔ)免疫后 2３周左右開始進(jìn)行高度免疫，注射 Ag多為 強(qiáng)毒 ，免疫原性良好，免疫劑量逐漸增加，免疫次數(shù)視血清抗體效價(jià)而定，一般 12次。 ? 常用的免疫動(dòng)物 ? 免疫的基本步驟 ? 兔子（ rabbit）、雞 (chicken)：最常用于自制抗體，抗體量較多。 酶標(biāo)抗體的應(yīng)用 —— 免疫酶技術(shù) ? 其基本過程是將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶試驗(yàn)，底物顯色后，用肉眼或分光光度計(jì)判定結(jié)果，其過程如下。 (2) 于上液中加入 NaIO４溶液，室溫下避光攪拌 20分鐘。 ? ２、 酶標(biāo)抗體的制備 ? 用于標(biāo)記的抗體要求高純高、高效價(jià)、與抗原的結(jié)合力強(qiáng)，以提取的 IgG最為理想。 ? 鏡檢： ? 在熒光顯微鏡下進(jìn)行檢查，抗原所在部位呈黃綠色熒光。應(yīng)用 FITC進(jìn)行溶解。 在 Ag、 Ab在凝膠中擴(kuò)散的同時(shí)加入電場作用，使 Ag、 Ab的擴(kuò)散速度加快，同時(shí)限制了擴(kuò)散的方向，增加了試驗(yàn)的敏感性。 ? SPA協(xié)同凝集試驗(yàn) 葡萄球菌 A蛋白（ staphylococal protein A,SPA)是葡萄球菌的特異性表面抗原，能與多種動(dòng)物 IgG的 Fc片段結(jié)合。 ? 常用的微載體： 致敏紅細(xì)胞、聚苯乙烯乳膠、炭粉顆粒 Ag + （紅細(xì)胞、乳膠、炭） 載體 載體 Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag 間接凝集反應(yīng) Ag ?將抗原結(jié)合在微載體上進(jìn)行的凝集試驗(yàn)叫 “ 正向間接凝集試驗(yàn) ” ； 將抗體結(jié)合在微載體上進(jìn)行的凝集試驗(yàn)叫 “ 反向間接凝集試驗(yàn) ” 。 免疫電泳技術(shù) 將瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)與電泳技術(shù)結(jié)合起來的一種免疫檢測技術(shù)。 ? FITC的標(biāo)記如下： ? ① 濃縮后的 IgG、定量、稀釋（ 10~20mg/ml） . ? ② FITC按蛋白量的 1/80－ 1/100加入。 ? 染色： ? 滴加熒光抗體，置 37℃ 染色 30～ 60min，用磷酸緩沖鹽水 (PBS)充分洗滌以除去未結(jié)合的熒光抗體，加 1滴，用蓋玻片封固。根據(jù)有色產(chǎn)物的有無及濃度，可對(duì)抗原及抗體做定性、定位和定量測定。 NaIO４法標(biāo)記步驟 : (1) 稱取 5mgHRP溶解于 1ml蒸餾水中。 ? 酶聯(lián)免疫吸附測定 (enzyme linked immunosorbent assay)簡稱 ELISA： 用于可溶性抗原或抗體的定量 ， 是一種既特異又敏感的方法 。 使用最廣泛的是： 125I ① 性質(zhì)活潑、易制備標(biāo)記物 ②對(duì)被標(biāo)記物的免疫活性影響小 ③測量方法簡便、已推廣 ④半衰期較長、核素豐度高 三、 免疫制備技術(shù)
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