[自然科學(xué)]免疫學(xué)試驗(yàn)技術(shù)-wenkub.com
2025-02-17 05:20 本頁面
【正文】 ? 適合于 IgM類抗體的純化 ? 原理 ? 利用蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合 (抗體 抗原，受體 配體）將一種配基與凝膠顆粒結(jié)合 ,捕捉與它相配的物質(zhì)。 在 ， IgG不帶電荷，不能被 DEAE纖維素（帶正電）吸附而被洗脫下來。 因此常用 33％飽和度的硫酸銨提取血清中的 IgG。 血清抗體的分離與純化 免疫球蛋白（ IgG)的制備 ? 硫酸銨分段沉淀法 蛋白質(zhì)是親水膠體，在水溶液中形成水 — 蛋白質(zhì)結(jié)合物；當(dāng)加入鹽后，鹽離子干擾蛋白質(zhì)和水分子間氫鍵的形成（ 水 — 鹽結(jié)合比水 — 蛋白質(zhì)結(jié)合更穩(wěn)定 ），從而使之失 “ 水 ”而凝集，由此降低了蛋白質(zhì)的溶解度而被沉淀析出。 ? 卡介苗等分支桿菌細(xì)胞壁中的粘肽（ 胞壁酰二肽， MDP）具有很強(qiáng)的佐劑活性，它能活化巨噬細(xì)胞，在注射部位形成肉芽腫，吸引吞噬細(xì)胞，進(jìn)一步增強(qiáng)吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的活性，使其更易于捕獲抗原。 水相： 96%Ag液， 4%吐溫 80（聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯），混勻。 ? 鉀明礬： KA1（ SO4） 2 .12 H20先配成 10%溶液，應(yīng)用時加入 12%量與抗原混合。 健康動物 首免 （常規(guī)劑量） 二免 （倍量同種疫苗） 高度免疫 （強(qiáng)毒或滅活疫苗） 弱毒苗 /滅活苗 12周 23周 ? 注意： ? （１）一般遵循 劑量（抗原量）漸增，毒力漸強(qiáng) 的原則 (弗氏佐劑除外） 。有時還需進(jìn)行 3次以上的免疫。（ Wistar大鼠） ? 羊（ sheep、 goat）：常用于較大批量地 生產(chǎn)抗體（商品）。 使用最廣泛的是： 125I ① 性質(zhì)活潑、易制備標(biāo)記物 ②對被標(biāo)記物的免疫活性影響小 ③測量方法簡便、已推廣 ④半衰期較長、核素豐度高 三、 免疫制備技術(shù) 抗原制備 抗體制備 抗體和細(xì)胞因子 純化 完全抗原制備 人工抗原制備 血清抗體制備 單克隆抗體制備 硫酸銨鹽析 離子交換層析 凝膠過濾層析 免疫親和層析 用 途 類 型 用于免疫動物，檢測抗體 用于免疫動物，檢測抗體 用于檢測抗原 用于檢測抗原 初步提純 進(jìn)一步純化 進(jìn)一步純化 高度純化 抗體標(biāo)記或致敏 免疫酶技術(shù) 熒光抗體技術(shù) 放射免疫測定 間接凝集試驗(yàn) 技 術(shù) 酶標(biāo)記抗體 熒光標(biāo)記抗體 同位素標(biāo)記抗體 致敏抗體 /抗原的制備 免疫血清的制備 為含有高效價特異性抗體的血清制劑。 二 抗？ ? 抗抗體： 抗異種動物的抗體，如 兔抗豬 二抗、 兔抗雞 二抗。 ? 酶聯(lián)免疫吸附測定 (enzyme linked immunosorbent assay)簡稱 ELISA： 用于可溶性抗原或抗體的定量 ， 是一種既特異又敏感的方法 。 (5) 加 4mg／ ml NaBH４液，混勻，再置 4℃2 小時。 NaIO４法標(biāo)記步驟 : (1) 稱取 5mgHRP溶解于 1ml蒸餾水中。 標(biāo)記的方法 以雙功能交聯(lián)劑為 “ 橋 ” ，分別與酶和抗體（抗原）連接形成結(jié)合物。根據(jù)有色產(chǎn)物的有無及濃度，可對抗原及抗體做定性、定位和定量測定。 ? 鏡檢： ? 抗抗體必須與抗血清是相應(yīng)的 ， 如該抗血清是豬源的 ， 則用兔抗豬熒光抗體 。 ? 染色： ? 滴加熒光抗體，置 37℃ 染色 30～ 60min，用磷酸緩沖鹽水 (PBS)充分洗滌以除去未結(jié)合的熒光抗體，加 1滴，用蓋玻片封固。 2－ 4℃ 須 6h 20－ 25℃ 須 1－ 2h即可。 ? FITC的標(biāo)記如下： ? ① 濃縮后的 IgG、定
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