關(guān)于western和酶切的問題(編輯修改稿)
2025-02-10 08:45 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 達分離膠底部，結(jié)束電泳。5）轉(zhuǎn)膜：將與分離膠大小一致的NC 膜100％甲醇中浸泡1min，與分離膠、濾紙墊和海綿墊一起放入預冷的1轉(zhuǎn)膜緩沖液中15min。按操作說明安裝轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)：從負極到正極依次為海綿墊、濾紙墊、分離膠、NC 膜、濾紙墊和海綿墊。充滿預冷的1轉(zhuǎn)膜緩沖液，在負極側(cè)放入冰盒，以維持轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)溫度不致太高。恒壓100V，轉(zhuǎn)90min。6）抗原抗體反應：電轉(zhuǎn)結(jié)束后，取出NC 膜，標記正反面后在TBS 中漂洗。7）麗春紅溶液染膜2min，去離子水漂洗，可以看到紅染的分子量大小不一的蛋白。TBST 洗去麗春紅。8）5％脫脂奶粉室溫下阻斷60min，TBST 洗，10min3 次。9）孵育一抗：分別加入1：800 一抗稀釋液 稀釋的兔抗大鼠OAT1多克隆抗體，1:400一抗稀釋液稀釋的兔抗大鼠OAT3多克窿抗體和1:1000 TBST 稀釋的βactin。4℃振蕩過夜后，TBST 洗，10min3次。10）孵育二抗：加入1：1000 5％脫脂奶粉稀釋的HRP 標記的抗兔二抗，室溫下孵育60min 后，TBST 洗，10min3 次。11）顯影檢測：按Phototope174。HRP Western Blot Detection System（CST，USA）操作規(guī)范，去離子水稀釋20X LumiGLO174。 和20xPeroxide 成1x工作液。把NC 膜浸入ECL 發(fā)光液1min，濾紙吸除過多水份，保鮮膜包裹后放入暗盒。暗室中把KODAK膠片放入暗盒，曝光1min。然后放入自動洗片機中沖洗和烤干。12）圖像分析：在凝膠成像和化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)上掃描和進行灰度分析。,KATPase活性：按照南京建成生物研究所NaKATPase活性試劑盒說明書測定基側(cè)膜Na，KATPase活性
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