限制性內(nèi)切酶的應用(編輯修改稿)
2024-09-12 00:25 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 CCGG…… 3’，如果其中有 5’甲基胞嘧啶，則只有 HpaⅡ 能夠切割。這些有相同切點的酶稱為 同裂酶（同切酶或異源同工酶） 。 同裂酶和同尾酶： 有時兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為 同尾酶 ，可以通過 DNA連接酶將這類末端連接起來，但原來的酶切位點將被破壞，有時可能會產(chǎn)生一個新的酶切位點。如 Xba Ⅰ(T`CTAGA) 、Nhe Ⅰ(G`CTAGC ） 、 Spe Ⅰ(A`CTAGT) 切割的 DNA序列不同，但均給出相同的 “ CTAG”粘性末端。這些粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割，但卻產(chǎn)生了一個新的 4核苷酸的酶切位點，即 Bfa Ⅰ （ C`TAG) 的酶切位點。 同尾酶： 限制性內(nèi)切酶的應用 ?克?。ㄓ袝r與甲基化酶聯(lián)用） ?鑒定（基因片斷大小、正反向） ?檢測突變 （識別位點，限制酶切圖譜的多態(tài)性） ? 制作 Marker 單酶切與雙酶切的選擇策略 運用載體的限制 載體的自身環(huán)化（挑選陽性克隆的工作量） 克隆的方向（鑒定 ） Insert EcoR1 Xho1 質粒 該實驗用質粒 pCMVMycT10經(jīng) EcoRⅠ 單酶切后應為 ；用 EcoRⅠ 和 XhoⅠ 雙酶切后應產(chǎn)生兩條 DNA片段，一條是 ，另一條是 （如下圖）。 限制性片段長度多態(tài)性 RFLPs ( restriction fragment length polymorphisms) 1987年，第一張較完整的人基因連鎖圖， 500多個 RELP 位點，定位了 Huntington病， CF（囊性纖維化）和癌相關基因（ APC， DCC 等） RFLP在遺傳病檢測中的應用 鐮狀細胞貧血癥（ ? globin， ?6 ），其 GAG?GTG的突變，可用 RFLP（ Mst II，CCTNAGG）或 PCRSSCP檢出。 甲型血友?。?FVIII－ ， XR） 可用 PCRRFLP檢出。 142 bp 99 bp 引起鐮刀型紅細胞貧血癥的原因就是基因的點突變，即編碼血紅蛋白 β肽鏈上一個決定谷氨酸的密碼子 GAA變成了 GUA，使得 β肽鏈上的谷氨酸變成了纈氨酸，引起血紅蛋白的結構和功能發(fā)生了根本的改變。 β肽鏈基因上單個核苷酸的替換 A→U 恰好使該基本片段丟失了可被 Mst II或CvnⅠ 切開的一個限制性內(nèi)切酶位點。由于基因突變改變了限制性酶切的結果，用 Southern blot分析方法和限制性片段長度多態(tài)性（簡稱 RFLP）分析方法即可對鐮刀型紅細胞貧血癥胎兒做產(chǎn)前診斷，或對發(fā)病家族成員的基因組型進行分析。 μg的 1kb DNA Ladder %TAE瓊脂糖凝膠， EB染色 數(shù)據(jù)庫 限制性內(nèi)切酶的數(shù)據(jù)庫 其中含有已知的所有限制性內(nèi)切酶的完整表，包括識別的序列，甲基化的敏感性，商業(yè)信息和參考文獻。 應用中的注意點 建
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