6第6章dna重組技術(shù)(編輯修改稿)
2025-02-09 07:34 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 R322載體是最早被廣泛應(yīng)用克隆的載體之一 pBR322載體的組成：? 來(lái)源于 ColE1的派生質(zhì)粒 pMB1的復(fù)制起始位點(diǎn)? 來(lái)源于 pSF2124質(zhì)粒易位子 Tn3的 Ampr? 來(lái)源于 pSC101質(zhì)粒的 Tetr 一、質(zhì)粒載體pBR322質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：（ ori） （ Ampr和 Tetr）作選擇標(biāo)志 一、質(zhì)粒載體 易于自身 DNA的純化，而且能有效地克隆 6kb大小的外源 DNA片段。 每個(gè)細(xì)胞達(dá) 1000～ 3000個(gè)拷貝。 一、質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒載體r rpBR332質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖（二） pUC質(zhì)粒載體系列 在 pBR322基礎(chǔ)上改建而成 一、質(zhì)粒載體典型的 pUC質(zhì)粒載體有 4個(gè)組成部分：? 來(lái)自 pBR322 質(zhì)粒的 復(fù)制起始點(diǎn)? Ampr基因? 大腸桿菌 β 半乳糖苷酶基因（ LacZ）啟動(dòng)子及編碼 α 肽鏈的 DNA序列（ LacZ′ 基因 ）? 多克隆位點(diǎn) （位于 LacZ′ 基因中靠近 5′ 端） 一、質(zhì)粒載體pUC系列的優(yōu)越性最通用的大腸桿菌克隆載體之一優(yōu)點(diǎn)? 具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)? 僅保留了 pBR322的復(fù)制子和 Ampr? 具有來(lái)自大腸桿菌 LacZ操縱子的 LacZ′ 基因，適應(yīng)于組織化學(xué)篩選重組體 一、質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒載體rpUC18/pUC19質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)二、噬菌體載體? λ 噬菌體載體 ? 粘粒載體稱柯斯質(zhì)粒（ cosmid）? 單鏈絲狀噬菌體載體 二、噬菌體載體λgt10（插入型）結(jié)構(gòu)二、噬菌體載體Charon 40（替換型）結(jié)構(gòu)二、噬菌體載體r粘粒載體 pJB8結(jié)構(gòu)二、噬菌體載體M13mp18/M13mp19 結(jié)構(gòu)三、穿梭載體? 同時(shí)具有原核和真核細(xì)胞的復(fù)制起始點(diǎn)? 真核生物的克隆載體常構(gòu)建成穿梭載體，使其先在大腸桿菌中擴(kuò)增，再轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞? 若加上適當(dāng)?shù)恼婧藛?dòng)子等元件，則成為真核表達(dá)載體，能在真核細(xì)胞中表達(dá)插入載體中的外源基因三、穿梭載體 真核系統(tǒng)載體還必需具備適當(dāng)?shù)暮Y選標(biāo)記? 使用遺傳缺陷型細(xì)胞株與載體的基因產(chǎn)物互補(bǔ)（如 TK基因產(chǎn)物）? 抗新霉素基因三、穿梭載體（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（一） SV40（猿猴病毒）載體（一） SV40（猿猴病毒）載體 真核表達(dá)載體中的調(diào)控元件大都來(lái)源于SV40的調(diào)控順序和復(fù)制信號(hào) ? 用 SV40 DNA與外源 DNA構(gòu)建重組子，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后允許細(xì)胞形成含外源 DNA的病毒顆粒? 重組子不包裝成病毒顆粒，而在細(xì)胞中復(fù)制或整合到染色體組中 三、穿梭載體例： PSVK3質(zhì)粒 PSVK3是一類廣泛適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)外源基因的穿梭載體。三、穿梭載體PSVK3具有下列構(gòu)件：：– 復(fù)制子和絲狀噬菌體復(fù)制起始位點(diǎn) fl– 篩選標(biāo)志（ Ampr） – 啟動(dòng)子（ T7啟動(dòng)子）：? SV40復(fù)制起始點(diǎn)? SV40早期啟動(dòng)子三、穿梭載體：? SV40小 T抗原拼接信號(hào)? SV40早期區(qū) mRNA polyA加尾信號(hào)： SV40啟動(dòng)子下游有 8個(gè)酶切位點(diǎn)三、穿梭載體三、穿梭載體pSVK3質(zhì)粒（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn)：? 具有廣泛的哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主? 較大的容量，能插入 7kb甚至更大的外源基因三、穿梭載體? 病毒基因組自身含有完整高效的調(diào)控元件? 病毒可通過主動(dòng)感染方式進(jìn)入宿主細(xì)胞，并能有效地整合到宿主染色體基因組中，與染色體一起復(fù)制、長(zhǎng)期存在? 逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體需要相應(yīng)的外包裝，以形成完整的體系三、穿梭載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的局限性：? 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)入細(xì)胞依賴于細(xì)胞表面的受體，并且只能感染并整合到分裂增殖期的細(xì)胞? 裝載容量較小，僅 8kb左右? 可能存在具有復(fù)制能力的野生型病毒三、穿梭載體 常用外源 DNA片段取代病毒中的癌基因，即卸去其致癌性，稱為卸甲載體（ disarmed vector）。 三、穿梭載體四、人工染色體? 酵母人工染色體（ YAC）? 細(xì)菌人工染色體（ BAC）? 噬菌體 P1衍生的人工染色體（ PAC）? 哺乳動(dòng)物人工染色體（ MAC） YAC主要調(diào)控元件? 著絲粒：保證染色體細(xì)胞分裂過程中正確分 配到子代細(xì)胞? 端粒：防止染色體被核酸外切酶降解? 復(fù)制起始點(diǎn)和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)四、人工染色體? 篩選標(biāo)志： 酵母中一般通過色氨酸、亮氨酸、組氨酸或尿嘧啶的合成基因產(chǎn)物插入失活而進(jìn)行篩選? 原核序列及調(diào)控元件： 包括大腸桿菌復(fù)制起始點(diǎn)、 Ampr基因等四、人工染色體YAC作為載體的主要特點(diǎn)：? 酵母是單細(xì)胞真核生物，培養(yǎng)方
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