重組dna技術(shù)(編輯修改稿)
2024-08-28 14:17 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 片斷 克隆載體 重組 DNA分子 含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 限制性內(nèi)切酶 受體菌 基因組 DNA文庫 存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組 DNA的集合 * 從基因組 DNA文庫獲取目的基因 目 錄 mRNA cDNA 雙鏈 cDNA 重組 DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制 * 從 cDNA文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶 Ⅰ 堿水解 T T T T 目 錄 （三）外源基因與載體的連接 （二）克隆載體的選擇和構(gòu)建 目的基因 載體 限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶 T4 DNA連接酶 15186。C 重組體 載體自連 目的基因 自連 目 錄 受體菌條件 安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài) (petent) 導(dǎo)入方式 轉(zhuǎn)化 (transformation) 轉(zhuǎn)染 (transfection) 感染 (infection) （四）重組 DNA導(dǎo)入受體菌 （五）重組體的篩選 1. 直接選擇法 (1) 抗藥性標(biāo)記選擇 (2) 標(biāo)志補(bǔ)救 (marker rescue) (3) 分子雜交法 原位雜交 Southern印跡 2. 免疫學(xué)方法 如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等 平板篩選 是指利用載體的遺傳性標(biāo)記在平板上直接篩選的方法。 具有抗藥性標(biāo)記的載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，能 在含抗生素（ Amp或 Tet）的培養(yǎng)平板上生長；未轉(zhuǎn) 化的則不能生長。 1. 插入失活 當(dāng)外源 DNA序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使 該基因失活，轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長在含相應(yīng)抗生素的 培養(yǎng)平板上。 (插入失活法 ) 抗藥性標(biāo)記選擇 目 2. 藍(lán) 白 篩選 利用藍(lán)色化合物的形成作為指示劑 ， 篩選帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌 。 載體： 編碼 β 半乳糖 宿主： 編碼 β 半乳糖 苷酶 N端 序列 苷酶 C端 序列 α 互補(bǔ) 細(xì)菌表達(dá)： β 半乳糖苷酶活性 ↑ 5溴 4氯 3吲哚 （ Xgal） → 形成 藍(lán)色菌落 當(dāng)在質(zhì)粒中 插入外源 DNA→β 半乳糖苷酶的 N端基因失活 → 不能與宿主 β半乳糖苷酶的 C端 進(jìn)行 α 互補(bǔ) → 產(chǎn)生 白色菌落 。 （ IPTG 存在下 ） 組氨酸缺陷 型大腸桿菌 無組氨酸 的培養(yǎng)基 酵
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