凝膠電泳ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-29 12:02 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 室溫進行，PFGE一般應在 4℃ 進行。較高的溫度 DNA泳動較快；但是較高的溫度也引起較小片段的泳動截留和明顯的條帶變寬。 種類 1) 按凝膠材料分 : 聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳 (普通瓊脂糖和低熔點瓊脂糖 ) 2) 按電泳裝置分 : 水平式 /瓊脂糖凝膠 。 豎式 /聚丙烯酰胺凝膠 3) 兩種方法比較：分離效果和分離范圍 。 操作難易 2. 用途 瓊脂糖凝膠用于 DNA和 RNA的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。 3. 凝膠電泳的一般程序 制膠 點樣 電泳 染色 觀察 DNA電泳 1. DNA分子種類 1) 線狀 DNA— 單鏈與雙鏈 ， ssDNA電泳時要注意局部區(qū)域形成 dsDNA， 造成遷移距離不確定 2) 環(huán)狀 DNA— 單鏈 （ 如 M13mp） 和雙鏈 （ 質粒 DNA） 3) 線狀 dsDNA電泳 — 使用頻率最高的一種電泳 這類 DNA分子在電泳過程中遷移的距離受以下幾個因素的影響： i. 分子量 的大小 : 遷移距離與分子量的 常用對數(shù) 成反比 ii. 凝膠濃度 : 濃度越高，移動距離越短，適合分離低分子量DNA濃度越低，移動距離越長，適合分離高分子量 DNA : 低電壓時，遷移率與電壓成正比；電壓增高時，不同大小 DNA片段遷移率增大是不同的。 : 不受影響 ,溫度高可導致 DNA帶變形或解鏈。 4) 環(huán)狀 dsDNA電泳 : 常用于質粒 DNA的初步鑒定 5) 線狀 ssDNA電泳 鏈分離凝膠 ：化學定序時，用于單鏈分離。 DNA雙鏈互補，但組成不一樣，仍可分離（機理不詳），電泳時形成三條帶：變性雙鏈，兩條單鏈。 核酸定序凝膠 (染料指示劑 )：為避免局部區(qū)域產(chǎn)生二級結構，可采用各種變性措施，如煮沸樣品，提高電泳溫度，凝膠中加入變性劑（尿素、甲醛、甲胺等） RNA凝膠電泳 方法：不同的 RNA電泳方法是依據(jù)使 RNA分子變性所采取的方法。這些方法不僅要使 RNA分子在點樣時是一級結構，而且在整個電泳過程中也保持一級結構。 1. 乙二醛 /二甲基亞砜法 原理：乙二醛可以與核酸、核苷酸及堿基發(fā)生反應，特別是鳥苷形成一個穩(wěn)定的附加環(huán)，從而阻止 GC堿基的互補作用發(fā)生 步驟： RNA+10mM羥甲基醛和 50% DMSO混合 50℃ 、 1 h變性 點樣 電泳 染色 觀察 2. 羥甲基汞法 原理：羥甲基汞可與 RNA分子的嘌呤或嘧啶堿基發(fā)生反應，反應部位是在可形成氫鍵的亞氨基處。 步驟： RNA+10mM羥甲基醛 點樣在含 4mM羥甲基醛的瓊脂糖凝膠上 電泳 染色觀察 3. 甲醛法 步驟： RNA+ +50%甲胺 點樣在含 糖凝膠上 MOPS緩沖液電泳 染色觀察 其它變性劑，如尿素、甲胺等也可用于 RNA電泳 . 4. 三種方法的比較 第一種方法安全，但由于反應是不可逆的，由此回收的 RNA樣品用于體外翻譯效果不好。第二、三種方法的反應可逆，回收RNA樣品可用于體外翻譯反應，但操作必須小心，因兩種變性劑有毒。 蛋白質電泳 方法：變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 ， 前者常稱之為 SDSPAGE。 差別：有無變性劑 用途：非變性凝膠可用于蛋白質的分離純化過程中 ， 可直接用于酶促反應 （ 顏色變化 ） SDSPAGE可用于蛋白質分子量 、 亞基組成的測定 。 mRNA翻譯產(chǎn)物 ， 基因表達產(chǎn)物測定等 。 核酸片段的分離與回收 — 用于 DNA、 RNA以及蛋白質的回收 1) 電洗脫法 : 利用電泳方法將凝膠中的特定核酸分子到其它介質中； 2) 濾紙法 — 核酸凝膠染色 長波紫外光確定位置 在分離帶前方切一口子并插入濾紙條 (其背面覆蓋透析袋膜 ) 電泳至 DNA帶全部進入濾紙條 洗脫 DNA 純化、沉淀 3) 透析袋法 — 切下含 DNA帶瓊脂塊 放入透析袋，封口 放入電泳槽 電泳 2~3小時至全部 DNA離開凝膠塊 反向電泳 1分鐘 取出 DNA液 純化、沉淀 4) 凍融法 5) 酶解法 待回收 DNA 切口 DNA 切口 凝膠塊 濾紙法 透析袋 凝膠塊 待回收 DNA 透析袋法 待回收 DNA 凝膠塊 V型槽 電洗脫槽法 回收 DNA方法 影響回收率的因素 1） DNA分子大小 — 回收率與分子量大小呈負相關； 2）乙醇沉淀 — 其中溫度、時間和 DNA濃度（回收時體積）均與回收率有關； 3）離心時間 — 時間越長，效果越好，對低濃度 DNA尤其明顯。 回收 DNA片段質量 凝膠材料的質量，如瓊脂糖中的硫酸鹽 沉淀劑若改用精胺，它可有效地去除 PEG、核苷酸、鹽、聚丙烯酰胺及蛋白質等。 二、 基因擴增 （ gene amplification） ? 主要內(nèi)容： ? ? ，將目的基因在宿主細胞進行擴增 ? ，生物體內(nèi)相關保衛(wèi)基因的擴增。 ? ? 三、分子雜交
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