第五章雙向凝膠電泳2d-page(編輯修改稿)
2025-08-28 13:14 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 F Cell 等電聚焦儀： Amersham pharmcia Biotech公司 IPGphor等電聚焦儀： 電極區(qū)域為銅鍍金板 ； 最多上 12個樣品 ； 平臺溫度為 1825℃ 177。 1℃ ； 膠條槽 (Holder) 體為氧化鋁陶瓷，丙烯酸的蓋子；適合 1 13和 18cm的膠條 ； 程序參數(shù)包括重泡脹時間 、 平臺溫度 、 每根膠條的最大限流 、 每步的電壓 、 每步的電流改變模式 、 每步的時間 ； 可編輯 10個程序 ， 每個程序分有九個步驟 ； 電壓輸出最大為 8000V； 最大電流為 ； 最大功率為 12W。 第二向： BIORAD公司 PROTEAN II xi Cell電泳槽： 電極是直徑為 ；適用于 20cm 凝膠電泳；凝膠厚度為 ；可同時運(yùn)行 12塊膠；上槽緩沖溶液 350ml，下槽緩沖溶液 L；典型 SDSPAGE電泳時間：無冷卻時為 5小時，帶冷卻時為 。配套電源為 Power Pac 1000：在進(jìn)行電泳時，最大電壓不超過 1000V，最大功率不超過 80W，最大室溫不超過 50℃ 。 Amersham pharmcia Biotech公司 Ettan DALT II System： (1) 此系統(tǒng)的電源控制為 Power Supply/Control Unit：最大輸出功率是200W；溫度控制范圍是 1050℃ 最大電壓 600V；最大電流 1A。 (2) 使用 Gel caster灌膠模具：最多可同時灌 、 1mm厚的梯度膠或均一膠 14塊。 Amersham pharmcia Biotech公司 Hoefet miniVE electrophoresis and electrotransfer Unit： 膠大小為 8cm 。最多可同時跑兩塊膠；跑一塊膠時需 ，跑兩塊膠時需 ； 最大電壓是 600V， 最大功率是 25W； 所配置電源為 Electrophoresis Power Supply EPS 301。 圖像分析軟件： ? Amersham pharmcia Biotech公司： imageMasterTM 2D version: ? BIORAD公司： PDQuesTM 4. 雙向電泳分析中的樣品制備 ? 應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。 ? 防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。 ? 防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。 ? 完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。 ? 盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。 特殊樣品的制備 低豐度蛋白的分離： 盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時的低豐度蛋白的量 , 但同時增加了高豐度蛋白的負(fù)荷 ，且造成蛋白的疊加效應(yīng)而影響分離 。 現(xiàn)常用預(yù)分級＋窄 pH膠的微制備技術(shù)進(jìn)行分離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群 ，再用 pH梯度小于 2個 pH單位的 IPG膠進(jìn)行窄 pH范圍的分離 。 強(qiáng)堿性蛋白質(zhì) （ 如核糖體 ） 的處理： 先將蛋白預(yù)處理以富集 ， 再用特殊 pH梯度的 IPG膠條 （ 如 pH31 412或 1012) 進(jìn)行等電聚焦 。 其中窄范圍堿性 IPG膠 （ 如 pH1012) 的挑戰(zhàn)是克服反向 、 陰極向陽極 、 電滲流和水平條紋模式 ， 而寬范圍的堿性 IPG膠 （ 如 pH31 412) 等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液 。 極端分子量的蛋白質(zhì)： 小于 8kD和大于 200kD的蛋白在常規(guī) IPG2D上不易看到 ， 這可能是在 Tris/glycine緩沖液中 ， 樣品和游離的 dodelcyl sulfate ions持續(xù)積累濃縮 ， 與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對流混合 ， 產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶 ， 從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端 ， 高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難 。 至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下 ， 蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽 ， 或者可能是大分子 。 5. 雙向凝膠電泳技術(shù)流程 IPG重泡漲及樣品加樣 第一向等電聚焦 第二向 SDSPAGE 檢測 問題及解決辦法 IPG膠條的重泡脹 ? 重泡漲時間至少要 10h， 泡漲不充分會影響相對分子量較高的蛋白質(zhì)的吸收 。 ? 重泡漲液的體積和膠條的長度相匹配，操作時需參照相關(guān)說明書。 ? 不同的 加樣方法和加樣量 會導(dǎo)致最終結(jié)果的差異。 ? 溫度的選擇：重泡漲及等電聚焦時溫度一般穩(wěn)定在 20℃ ，太低尿素會結(jié)晶出來，溫度不穩(wěn)也會造成膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)位置的變化。 ? 重泡漲時加上 3050V的低電壓會促進(jìn)膠條對蛋白質(zhì)的吸收，但這一點(diǎn)在制備型電泳時才有意義。 ? 商品化的膠條使用前是以干膠條的形式和塑料支撐薄膜粘在一起，加樣前需要先撕去薄膜在重泡漲液中泡漲。重泡漲液的成分是： 8mol/L Urea, 2% CHAPS, 18mmol/L DTT, %IPG Buffer, 痕量 Bromophenol Blue，和裂解液成分基本相同，在 10100mmol/L濃度范圍內(nèi)適當(dāng)提高 DTT的濃度可提高蛋白質(zhì)的檢測靈敏度。 ? 重泡漲可在等電聚焦盤內(nèi)進(jìn)行，此時樣品已經(jīng)加到重泡漲液中，在加樣杯上樣 (cup loading) 方式中，膠條在專門的重泡漲盤內(nèi)泡漲完成后再轉(zhuǎn)入等電聚焦盤內(nèi)加樣。 ? 泡脹的實質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)入 IPG內(nèi)，從
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