sdspage凝膠電泳ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-01 18:23 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 相對遷移率 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 1. 形成凝膠的試劑要有足夠的 純度 ：丙烯酰胺是形成凝膠溶液中的最主要成份，其純度的好壞將直接影響凝膠的質(zhì)量，丙烯酰胺可能混有的影響凝膠形成的雜質(zhì)有：丙烯酰胺、線性多聚丙烯酰胺、金屬離子等。 2. 注意不能隨便傾倒 單體溶液 ，應(yīng)加入過量的催化劑使其完全聚合成無毒性的聚丙烯酰胺后再棄置。 ? 3. TEMED中混有氧化試劑后其自身極易被氧化而失去催化能力，另外 TEMED的氧化產(chǎn)物 呈黃色 ，以此可以鑒定 TEMED的質(zhì)量。如果無法獲得無色透明的 TEMED，只能適當(dāng)增加用量以保證聚膠速度。 ? 4. 過硫酸銨 容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的過硫酸銨會(huì)漸漸失去活性。保存固體過硫酸銨應(yīng)密閉干燥。過硫酸銨溶液宜制膠當(dāng)天配制。另外在配制凝膠溶液時(shí)過硫酸銨不易過量，否則會(huì)使蛋白質(zhì)在電泳過程中被氧化 (主要指天然無變性劑凝膠 )。 ? 5. 激活劑的用量 : 激活劑的濃度適當(dāng)與否不僅可以決定凝膠聚合的速度，也將影響凝膠的質(zhì)量。增加過硫酸銨或 TEMED的用量，將使丙烯酰胺聚合鏈長度縮短，凝膠會(huì)變得脆弱而失去應(yīng)有的柔性。二者多至一定程度時(shí)，聚合鏈長度過短，將不會(huì)形成肉眼可見的凝膠，這些短鏈多聚物呈溶液狀，只是其粘度較聚合前高一些。 6. 溫度的影響 聚膠的最佳溫度為 23~25 ℃ ，需要注意灌膠前單體溶液 (通常置于 4℃ 冰箱 )及玻璃板或管 (有時(shí)從烘箱取出 )也要平衡至此溫度。由于溶液在抽真空時(shí)仍維持較低溫度，需待其升至室溫后再脫氣，另外升溫后脫去氧氣的速度較低溫時(shí)快。 7. 氧氣的影響 氧氣會(huì)與被激活的單體自由基作用抑制聚合過程，因此需在加激活劑前對單體溶液脫氣。如果省去這一步驟，凝膠仍能聚合但需更多的激活劑，并且不能保證很好的重復(fù)性，充分去除氧氣可以用盡量少的激活劑得到最佳聚合效果。通常在較好的真空度 (＜ 125torr)脫氣至少 15 min 。 8. 凝膠添加劑： 凝膠中常常加入 SDS、尿素、 Triton X100等添加劑。 SDS加入后不會(huì)對凝膠的聚合產(chǎn)生影響，但尿素會(huì)使凝膠孔徑變小，這一特性可用來分離小分子蛋白質(zhì)或多肽。 9. 聚膠時(shí)間： 雖然應(yīng)用過硫酸銨／ TEMED催化后灌膠 15~20 min即可觀察到凝膠的形成，但至少需90 min才能保證 95％以上的單鏈聚合成長短以及具有合適的孔徑大小。采用核黃素時(shí)聚膠時(shí)間需更長，但它一般用于等電聚焦即根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)進(jìn)行分離，對孔徑大小要求不高，因此不必等很長時(shí)間 (完全聚合需 8 h)。 10. 單體的濃度： 是指單體總重量 (丙烯酰胺+bis)在溶
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