凝膠電泳分離技術(shù)(編輯修改稿)
2025-08-09 21:44 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ，帶點(diǎn)顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子的大小，這就大大提高了分辨能力。根據(jù)相關(guān)性質(zhì)，可以分為：（1）低熔點(diǎn)凝膠，用于DNA片段的回收、酶切、連接等。（2）高熔點(diǎn)凝膠，用于分離小于1kb的DNA片段， PCR產(chǎn)物的分析。（3）快速凝膠，電泳速度較快，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間。（4）其他類型，依據(jù)機(jī)械強(qiáng)度和熔點(diǎn)選擇。（二）特點(diǎn)（1）凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒等大分子物質(zhì)。（2）操作簡單、快速，通過調(diào)整其使用濃度，使得分辨率可以達(dá)到大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的要求，成為分離、鑒定、純化核酸分子的常用方法。（3）瓊脂糖凝膠因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂的電滲。（4）對蛋白質(zhì)吸附極微，故無拖尾現(xiàn)象。（5）透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進(jìn)行染色。（6）不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量測定。（7）機(jī)械強(qiáng)度差，易破碎，濃度不能太低，易被細(xì)菌污染，不易保存。二、聚丙稀酰胺凝膠電泳（PAGE）（一）簡介聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N,N甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。帶有酰胺側(cè)鏈，沒有或很少有帶離子的側(cè)基，因而電滲作用比較小，不易和樣品相互作用。根據(jù)凝膠溶液和電泳緩沖液對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響，可分為兩種方式:一是非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開，在未變凝膠中分離DNA的缺點(diǎn)是DNA 的遷移率受堿基組成和序列的影響。由于無法得知未知 DNA的遷移是否反常，故不能用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳來確定分子的大小。二是用于分離及純化單鏈DNA 片段的變性聚丙烯酰胺凝膠。這類凝膠是在核苷酸堿基配對抑制劑（尿素或甲酰胺）的存在下聚合而成的。變性DNA的移動(dòng)速度同其堿基組成及序列幾乎完全無關(guān)，故可用于分離及純化單鏈DNA片段和DNA測序等。（二）特點(diǎn)（1）具有分子篩效應(yīng)，分辨率高（2）樣品不易擴(kuò)散，用量少，靈敏度可達(dá)10（3）化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，分子結(jié)構(gòu)中富含酰胺基，具有穩(wěn)定的親水基團(tuán)（4）凝膠不帶電荷，消除了電滲現(xiàn)象（5）機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，在一定濃度范圍內(nèi)無色透明（6）網(wǎng)孔可調(diào)節(jié)（三）十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基硫酸鈉聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋白質(zhì)。該技術(shù)最初由Shapiro于1967年建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑（SDS即十二烷基硫酸鈉）后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大?。梢院雎噪姾梢蛩兀Ｊ榛蛩徕c是一種陰離子去污劑，在水溶液中以單體和分子團(tuán)的混合形式存在。這種陰離子去污劑能破壞蛋白質(zhì)分子間以及與其他物質(zhì)分子間的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)分子的二硫鍵被還原劑打開并不易再氧化，這就保證了蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合從 （SDS結(jié)構(gòu)示意圖）而形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子與SDS結(jié)合后所帶上的SDS負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電量，因而也就掩蓋或消除了不同種類蛋白質(zhì)分子間原有的電荷差異。這樣的蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物在SDS聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中的電泳遷移率便不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀等因素的影響，而主要取決于蛋白質(zhì)分子量大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子質(zhì)量在1500020000之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下列方程式：lgMw=+K .式中，MW為蛋白質(zhì)的分子量，mR為相對遷移率，b為斜率，K為截距，在條件一定時(shí)，b和K均為常數(shù)。采用SDSPAGE系統(tǒng)作單向電泳，不僅可以根據(jù)
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