20xx年醫(yī)學專題—脈沖場凝膠電泳(編輯修改稿)
2024-11-18 23:14 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 T）纖維素層析 洗出液 乙醇沉淀（無多聚A mRNA） 5. RNA的質(zhì)量評估方法 1) 光密度值測定法 A260/A280=2.0 2) 凝膠電泳 3) 體外蛋白質(zhì)翻譯,第十七頁，共三十八頁。,第十八頁，共三十八頁。,第二節(jié) 核 酸 電 泳,第十九頁，共三十八頁。,1. 種類 1) 按凝膠材料分: 聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳(普通瓊脂糖和低熔點瓊脂糖) 2) 按電泳裝置分: 水平式/瓊脂糖凝膠。 豎式/聚丙烯酰胺凝膠 3) 兩種方法比較：分離效果和分離范圍。 操作難易 2. 用途 瓊脂糖凝膠用于DNA和RNA的常規(guī)(ch225。ngguī)分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。 3. 凝膠電泳的一般程序 制膠 點樣 電泳 染色 觀察 二、DNA電泳 1. DNA分子種類 1) 線狀DNA—單鏈與雙鏈，ssDNA電泳時要注意局部區(qū)域形成dsDNA，造成遷移距離不確定 2) 環(huán)狀DNA—單鏈（如M13mp）和雙鏈（質(zhì)粒DNA） 3) 線狀dsDNA電泳—使用頻率最高的一種電泳,第二十頁，共三十八頁。,這類DNA分子在電泳過程中遷移的距離受以下幾個(jǐ ɡ232。)因素的影響： i. 分子量 的大小: 遷移距離與分子量的常用對數(shù)成反比 ii. 凝膠濃度: 濃度越高，移動距離越短，適合分離低分子量DNA濃度越低，移動距離越長，適合分離高分子量DNA,iii.電壓: 低電壓時，遷移率與電壓成正比；電壓增高時，不同(b249。 t243。nɡ)大小DNA片段遷移率增大是不同(b249。 t243。nɡ)的。 iv.堿基組成與溫度: 不受影響,溫度高可導致DNA帶變形或解鏈。,第二十一頁，共三十八頁。,4) 環(huán)狀dsDNA電泳(di224。n yǒnɡ): 常用于質(zhì)粒DNA的初步鑒定 5) 線狀ssDNA電泳 鏈分離凝膠：化學定序時，用于單鏈分離。DNA雙鏈互補，但組成不一樣，仍可分離（機理不詳），電泳時形成三條帶：變性雙鏈，兩條單鏈。,核酸定序凝膠(染料指示劑)：為避免局部區(qū)域產(chǎn)生(chǎnshēng)二級結(jié)構(gòu)，可采用各種變性措施，如煮沸樣品，提高電泳溫度，凝膠中加入變性劑（尿素、甲醛、甲胺等）,第二十二頁，共三十八頁。,三. RNA凝膠電泳 方法：不同的RNA電泳方法是依據(jù)使RNA分子變性所采取的方法。這些方法不僅要使RNA分子在點樣時是一級結(jié)構(gòu)，而且在整個電泳過程(gu242。ch233。ng)中也保持一級結(jié)構(gòu)。 1. 乙二醛/二甲基亞砜法 原理：乙二醛可以與核酸、核苷酸及堿基發(fā)生反應，特別是鳥苷形成一個穩(wěn)定的附加環(huán)，從而阻止GC堿基的互補作用發(fā)生 步驟：RNA+10mM羥甲基醛和50% DMSO混合 50℃、1 h變性 點樣 電泳 染色 觀察 2. 羥甲基汞法 原理：羥甲基汞可與RNA分子的嘌呤或嘧啶堿基發(fā)生反應，反應部位是在可形成氫鍵的亞氨基處。 步驟：RNA+10mM羥甲基醛 點樣在含4mM羥甲基醛的瓊脂糖凝膠上 電泳 染色觀察,第二十三頁，共三十八頁。,3. 甲醛法 步驟：RNA+2.2M甲醛+50%甲胺 點樣在含2.2M甲醛瓊脂糖凝膠上 MOPS緩沖液電泳 染色觀察 其它變性劑，如尿素、甲胺等也可用于RNA電泳. 4. 三種方法的比較 第一種方法安全，但由于反應是不可逆的，由此回收的RNA樣品用于體外翻譯效果不好(b249。 hǎo)。第二、三種方法的反應可逆，回收RNA樣品可用于體外翻譯反應，但操作必須小心，因兩種變性劑有毒。 五、蛋白質(zhì)電泳 方法：變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者常稱之為SDSPAGE。差別：有無變性劑 用途：非變性凝膠可用于蛋白質(zhì)的分離純化過程中，可直接用于酶促反應（顏色變化） SDSPAGE可用于蛋白質(zhì)分子量、亞基組成的測定。mRNA翻譯產(chǎn)物，基因表達產(chǎn)物測定等。,第二十四頁，共三十八頁。,五、核酸片段的分離與回收 1
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