【正文】 。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找蛋白質(zhì)濃度。 【 注意事項 】 如果測定的要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入 520min內(nèi)測 定吸光度，在這段時間內(nèi)樣色很穩(wěn)定。 測定中，蛋白質(zhì) 染料復(fù)合物會吸附在比色皿上，實驗 證明可以忽視。測定完后可以用乙醇洗干凈。 【 思考題 】 根據(jù)一下要求選擇一種或者幾種蛋白質(zhì)定量測定蛋白 質(zhì)濃度。 （ 1）樣品不容易溶解，但要求結(jié)果很準(zhǔn)確。 （ 2）要求在半天內(nèi)測定 60個樣品。 （ 3）要求很迅速的測定一系列試管（ 30只）中溶液的蛋 白質(zhì)濃度 試著比較該法與其他幾種方法的優(yōu)缺點。 實驗三 血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳 【 實驗?zāi)康?】 掌握醋酸纖維素薄膜電泳的原理和操作過程 。 【 實驗原理 】 血清中各種蛋白質(zhì)的等電點不同，在 妥緩沖液中，各種蛋白質(zhì)所帶的凈電荷量不相等，加上蛋白質(zhì)分子大小不相同，在電場中移動的速度就不等，例如，白蛋白等電點比其他蛋白質(zhì)低，在 電荷比其他蛋白質(zhì)多，加上白蛋白的分子較小，因此在電場中比其他蛋白質(zhì)移動速度快。這樣，血清蛋白質(zhì)在醋酸纖維素薄膜上就可以形成區(qū)帶，用以分離和分析蛋白質(zhì)。 【 實驗試劑與器材 】 （一）儀器 電泳儀； 電泳槽； 恒溫水浴箱； 721型分光光度計 （二）材料 人血清或雞血清 醋酸纖維素薄膜 （三）試劑 mol/L巴比妥鈉 HCL緩沖液（ ）：取巴比妥鈉 g，加蒸餾水約 800 ml溶解后，加入 lmol/L HCL ml，補加蒸餾水至 1000 ml，測試其 pH應(yīng) 為 。 2 、染色液：取氨基黑 10B g，磺基水楊酸 10 g，加冰 醋酸 20ml，蒸餾水 400ml，搖勻溶解。 漂洗液： ％醋酸 洗脫液： mol/L NaOH溶液 透明液：無水乙醇 7份，冰醋酸 3份混合即成。 【 實驗步驟 】 1．薄膜準(zhǔn)備 2．點樣 3．電泳 4．染色和漂洗 5．薄膜和透明 6．定量 （ 1）洗脫法 注意！白蛋白因加入 NaOH的量比其他管多，其光密度值應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)，得到數(shù)值再代入上式中計算。 + 白蛋白 (A) α2 β γ α1 %1 0 0% ?? 各管光密度讀數(shù)之和該種蛋白管光密度讀數(shù)）百分?jǐn)?shù)（每種蛋白占總蛋白量的（ 2）光密度計法 （ 3）用本法定量，正常人數(shù)值為： 白蛋白 % ~ % 540 ~ 730 g/L α1球蛋白 % ~ % 28 ~ 51 g/L α2球蛋白 % ~ % 63 ~ 106 g/L β球蛋白 % ~ % 52 ~ 110 g/L γ球蛋白 % ~ % 125 ~ 200 g/L 【 注意事項 】 1．醋酸纖維素薄膜的質(zhì)量對結(jié)果影響很大，最好選用同一批號、薄膜厚度均勻、質(zhì)量良好的醋酸纖維素薄膜。 2．血清或其他電泳樣品應(yīng)新鮮。 3．點樣應(yīng)細(xì)窄、均勻、集中。點樣量不宜過多，點樣位置要合適。 4．鹽橋要放置平整，保證電場均勻。 5．電泳槽蓋應(yīng)密封，蓋內(nèi)空間不宜過大。 6．較低溫度下電泳一般能獲得較好的圖譜，故室溫不宜過高。 7．選擇合適的緩沖液離子強度。 8．兩電泳槽內(nèi)緩沖液面應(yīng)在同一水平。 9．要控制好電流，電壓和電泳時間。 10．電泳槽內(nèi)緩沖液可以多次使用。但操作時應(yīng)盡量減少緩沖液的污染、水分蒸發(fā)、 pH及離子強度的改變，并應(yīng)防止霉菌的滋長。 11．染色、漂洗及洗脫時間要控制好，才能獲得重復(fù)性良好的定量結(jié)果。 【 思考題 】 1. 電泳后，泳動在最前面的為何種蛋白質(zhì)？分析原因。 2. 點樣時，置于電場的正極還是負(fù)極，為什么？ 實驗四 動物肝肝臟 DNA的分離與鑒定 【 實驗?zāi)康?】 學(xué)習(xí)常用的 DNA分離方法 。 【 實驗原理 】 在濃氯化鈉 (12mol/L)溶液中，脫氧核糖蛋白的溶解度很大，核糖蛋白的溶解很小。在稀氯化鈉 ()溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白 從樣品中分別抽提出來。 將抽提的核蛋白用 SDS(十二烷基硫酸鈉 )處理， DNA(或 RNA)即與蛋白質(zhì)分開，可用氯仿 異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去，而 DNA則溶解于溶液中。向溶液 中加入適量乙醇， DNA即析出。 為了防止 DNA(或 RNA)酶解，提取時加入 EDTA(乙二胺四乙酸）。 【 實驗試劑與器材 】 1． 5mol/LNaCl溶液：將 NaCl溶于水，稀釋至 1000ml。 2． ／Ｌ ／Ｌ EDTANa溶液： 溶 － Na于蒸餾水，稀釋至 1000ml。 3． 25％ SDS溶液：溶 25g十二烷基硫酸鈉于 100ml 45％乙醇。 ４． ／Ｌ檸檬酸三鈉溶液 ,氯化 鈉 ,稀釋至 1,000ml。 5 ． 氯仿 異戊醇混合液 :氯仿 :異戊醇 =24:1(V/V)。 6 ． ． 15mol／Ｌ檸檬酸三鈉溶液 : 氯化 鈉 ,稀釋至 1,000ml。 7 ． 3mol/L乙酸鈉 ／Ｌ EDTANa溶液：稱取 乙 酸鈉 408g、 ,稀釋至 1,000ml。 8 ． 70%乙醇、 80%乙醇、 95%乙醇、無水乙醇。 9 ． 二苯胺試劑。 10 ． 1mol／Ｌ過氯酸溶液，將 10ml過氯酸 (70%)用蒸餾 水稀釋至 11ml。 11 ． 實驗材料與儀器 大白鼠肝臟、勻漿器、離心機 5000r/min、量筒 50ml( 1)、 25ml( 1)、 10ml( 1)、吸管 5ml( 2)、水浴鍋、真空干燥器。 【 實驗步驟 】 1． DNA的分離純化： （ 1）將新鮮豬肝用 mol/／Ｌ EDTA溶液洗去血液，剪碎，加入 50 mol/LNaCl／Ｌ EDTA溶液 ,置勻漿器中研磨 .待研磨成糊狀后，將糊狀物離心 10min(4000r/min)，棄去上清液，沉 淀用 mol/／Ｌ EDTA溶液洗二、三次。所得沉淀為脫氧核糖核蛋白制品。 （ 2）向上述沉淀物加入 mol/／ＬEDTA溶液，使總體積為 44ml，然后滴加 25%SDS溶液3ml，邊加邊攪拌。加畢，置 60℃ 水浴保溫 10min(不停攪拌 )溶液變得粘稠并略透明，取出冷至室溫。此步操作 系使核酸與蛋白質(zhì)分離。 （ 3）加入 5mol／Ｌ NaCl溶液 10ml，使 NaCl最終濃度達(dá)到 1mol/L，攪拌 10min，加入約一倍體積的氯仿 異戊醇混合液，振搖 20min，離心 10min(4000r/min )。去掉沉淀，上層清夜徐徐加入 1． 5— 2倍 95%乙醇， DNA沉淀即析出，用玻棒慢慢攪動，則 DNA絲狀物即纏在玻棒上。 （ 4）將 DNA粗品置于 檸檬酸三鈉溶液中，再加入 ，攪勻，加入一倍體積氯仿 異戊醇混合液，振搖 10min，離心 (4000r /min， 10min)，傾出上層液 (沉淀