【正文】 沉淀放置后不變?yōu)樽丶t色或重濾后仍混濁，可在鎢酸與血混合液中加入 10％硫酸 1～ 2滴，待變?yōu)榘底厣? 再濾。 顯色時(shí)要避免高溫，采用混合酸液反應(yīng)時(shí)溫度不會(huì)升得太高，一般在 4~32℃ 時(shí)，顏色能穩(wěn)定 2h。直鏈淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈藍(lán)色；糊精按分子從大到小的順序，遇碘可呈藍(lán)色、紫色、暗褐色和紅色，最小的糊精和麥芽糖遇碘不顯顏色。搖勻， 20分鐘后取出 3支試管，各加碘溶液 2滴，混勻，比較各管溶液的顏色。 【 注意事項(xiàng) 】 沸水浴中的試管在加入碘液之前一定要在自來(lái)水下冷卻。當(dāng)抗壞血酸全部被氧化后，稍多加一些染料，使墑定液呈談紅色，即為終點(diǎn)。 【 實(shí)驗(yàn)步驟 】 1．不同樣品用不同方法提取 (1)松針：水洗凈，用濾紙吸去表面水分。靜置 10分鐘，過(guò)濾 (最初數(shù) m L濾液棄去 )。 【 思考題 】 試述本實(shí)驗(yàn)介紹的 2， 6二氯酚靛酚滴定法的優(yōu)缺點(diǎn)。在正常情況下，其產(chǎn)量甚微；患 糖尿病或食用高脂肪膳食時(shí)，血中酮體含量增高，尿中也能出現(xiàn)酮體。 酮體生成和沉淀蛋白質(zhì) 取 50ml錐形瓶 2只，編號(hào)，并按下表操作。同工酶的蛋白結(jié)構(gòu)既有差別，它們的理化性質(zhì)也就有所差異，因此可用電泳或其他方法將它們分離開來(lái)。取此溶化的凝膠 ，立即澆在電泳完畢的凝膠板上， 37℃ 避光保溫 1h，即顯示出五條深淺不等的藍(lán)紫色區(qū)帶。 利用等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理 ， 將牛乳的 pH調(diào)至 ， 酪蛋白就沉淀出來(lái) 。 30mL乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn) 移至布氏漏斗中抽濾。 【 實(shí)驗(yàn)原理 】 谷丙轉(zhuǎn)氨酶作用于丙氨酸及 α酮戊二酸，生成谷氨酸與丙酮酸。 。 【 思考題 】 ？ 。棄去清液，得酪蛋白粗制品。 【 實(shí)驗(yàn)原理 】 牛乳中的主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白 ， 含量約為35g/L。電泳 40~60min，電壓約100伏。 【 思考題 】 為什么說(shuō)脂肪酸 β氧化實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是制備新鮮的肝糜 ? 什么叫酮體 ?為什么正常代謝時(shí)產(chǎn)生的酮體量很少 ? 實(shí)驗(yàn)十 瓊脂糖膠電泳法分離乳酸脫氫同工酶 【 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?】 學(xué)習(xí)和掌握瓊脂糖凝膠電泳法分離乳酸脫氫酶同工酶的原理和方法。 （ 2）稱取肝組織 5g置研缽中，加少量 %NaCl溶液，研磨成細(xì)漿。乙酰乙酸、 β羥丁酸和丙酮總稱為酮體。 T=1ml染料能氧化抗壞血酸 mg數(shù)。然后稱取 20． 0g，加 2％草酸 100m1置組織攪碎機(jī)中打成漿狀。 5． ％ 2,6— 二氯酚靛酚溶液。在酸性溶液中， 2， 6— 二氯酚靛酚呈紅色，被還 原后變?yōu)闊o(wú)色。冷后，各滴入 2一 3滴碘溶液，混勻。） 2. 溫度對(duì)酶活性的影響 取 3支試管，編號(hào)后各加入淀粉溶液 2毫升。唾液內(nèi)的淀粉酶可將淀粉逐步水解成各種不同大小的糊精分子，最終產(chǎn)物為麥芽糖和少量的葡萄糖。 加畢，混勻，靜置 10min，以 550nm波長(zhǎng)比色測(cè)定，以吸光度值為縱坐標(biāo)，膽固醇含量為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果由吸 管中放出血液的速度太快，會(huì)有大量血液粘在吸管內(nèi)壁，容量不準(zhǔn)，所以一般放出 1ml血液所用的時(shí)間不應(yīng)少于 1min。每毫升無(wú)蛋白血濾液相當(dāng)于 。 堿性硫酸銅（現(xiàn)配現(xiàn)用）。 【 實(shí)驗(yàn)原理 】 葡萄糖是血液主要的糖類，因此測(cè)血糖含量就是測(cè)血液中葡萄糖的含量。 （ 3）加入 5mol／Ｌ NaCl溶液 10ml，使 NaCl最終濃度達(dá)到 1mol/L，攪拌 10min，加入約一倍體積的氯仿 異戊醇混合液，振搖 20min，離心 10min(4000r/min )。 9 ． 二苯胺試劑。 【 實(shí)驗(yàn)試劑與器材 】 1． 5mol/LNaCl溶液：將 NaCl溶于水，稀釋至 1000ml。 【 思考題 】 1. 電泳后，泳動(dòng)在最前面的為何種蛋白質(zhì)？分析原因。 5．電泳槽蓋應(yīng)密封，蓋內(nèi)空間不宜過(guò)大。 2 、染色液：取氨基黑 10B g，磺基水楊酸 10 g，加冰 醋酸 20ml，蒸餾水 400ml，搖勻溶解。 【 思考題 】 根據(jù)一下要求選擇一種或者幾種蛋白質(zhì)定量測(cè)定蛋白 質(zhì)濃度。 待測(cè)蛋白：人血清，用前用 %NaCl稀釋 200倍。 【 實(shí)驗(yàn)原理 】 考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量是利用蛋白質(zhì) 染料結(jié)合法的原理，定量測(cè)定微量蛋白質(zhì)濃度快速、靈敏的方法。用鉛筆描出斑點(diǎn)輪廓 (見(jiàn)圖 2)。 1 722型（或 7220型）分光光度計(jì)。 【 實(shí)驗(yàn)試劑與器材 】 溶劑系統(tǒng) （ 1）堿相溶劑： 正丁醇 :12%氨水 :95%乙醇＝ 13:3:3（體積比） （ 2）酸相溶劑： 正丁醇 :80%甲酸 :水＝ 15:3:2（體積比） 顯色貯備液： %水合茚三酮丙酮溶液 V（ %硫酸銅） :V（ 75%乙醇） =2:38溶液。此法廣泛地應(yīng)用于科研和生產(chǎn)分析工作中?！?生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) 》 課程簡(jiǎn)介 生物化學(xué)課程是一門與生物技術(shù)相關(guān)的專業(yè)基礎(chǔ)必修課，本實(shí)驗(yàn)課程是附屬于該課程的一個(gè)教學(xué)環(huán)節(jié)，開設(shè)操作性、驗(yàn)證性、綜合性等實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要進(jìn)行生物分子（蛋白質(zhì)、核酸、糖、維生素）的定性、定量測(cè)定和分離提取制備，學(xué)習(xí)酶活性和維生素的測(cè)定方法等實(shí)驗(yàn)，涉及了生物化學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)及典型儀器設(shè)備。所用設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，使用樣品少，分離效果好，為近 代生物化學(xué)分析中重要技術(shù)之一。若沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品，可選擇文獻(xiàn)記載的該物質(zhì)層析條件，根據(jù)文獻(xiàn) Rf值進(jìn)行鑒定 。 電吹風(fēng)（ 1）。 圖 1 濾紙的縫合 4．顯色 用噴霧器向?yàn)V紙上均勻噴灑 %茚三酮，晾干后，將濾紙放入烘箱中 (80100℃ )，烘烤 5分鐘后，濾紙上即顯出紫紅色的氨基酸斑點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)二 考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 【 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?】 學(xué)習(xí)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法。 %NaCl 考馬斯亮藍(lán)試劑： 100mg考馬斯亮藍(lán) G250溶于 50ml 5%乙醇中，加 100ml85%磷酸，蒸餾水稀釋 1000ml，濾紙過(guò)濾。測(cè)定完后可以用乙醇洗干凈。 【 實(shí)驗(yàn)試劑與器材 】 （一）儀器 電泳儀； 電泳槽； 恒溫水浴箱； 721型分光光度計(jì) （二）材料 人血清或雞血清 醋酸纖維素薄膜 （三）試劑 mol/L巴比妥鈉 HCL緩沖液（ ）：取巴比妥鈉 g，加蒸餾水約 800 ml溶解后，加入 lmol/L HCL ml，補(bǔ)加蒸餾水至 1000 ml，測(cè)試其 pH應(yīng) 為 。 4．鹽橋要放置平整，保證電場(chǎng)均勻。 11．染色、漂洗及洗脫時(shí)間要控制好，才能獲得重復(fù)性良好的定量結(jié)果。 為了防止 DNA(或 RNA)酶解，提取時(shí)加入 EDTA(乙二胺四乙酸）。 8 ． 70%乙醇、 80%乙醇、 95%乙醇、無(wú)水乙醇。此步操作 系使核酸與蛋白質(zhì)分離。 （ 2）掌握 FolinWu法測(cè)定血糖含量的原理和方法。 （ 2） B液：稱取硫酸銅 ，用蒸餾水溶解，然后用100ml容量瓶定容至刻度，加幾滴濃硫酸作為保存劑。 用奧氏吸管吸取已加抗凝劑的全血 1ml，緩緩放入 20ml錐形瓶中，加水 7ml，搖勻，血液變成紅色透明時(shí)加 10％鎢酸鈉 1ml，搖勻，再加 ，隨加隨搖，加完放置 5～ 15min，至沉淀由鮮紅變?yōu)榘底厣瑸V紙過(guò)濾。