【正文】 2. 谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的測定 1）取 4支試管，標(biāo)注名稱，按照下表操作 2）計算酶活力 本法規(guī)定：酶在 37℃ 與底物作用 30分鐘，產(chǎn)生 丙酮酸為一個谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性單位。 ，風(fēng)干；得酪蛋白純品。在攪拌下慢慢加入預(yù)熱至 40℃ 、 100mL，用精密 pH試紙或酸度 計調(diào) pH至 。 如需定量，可用光密度計測定各區(qū)帶。Na2溶液 %瓊脂糖凝膠 %~%瓊脂糖染色膠 顯色液 2%醋酸緩沖液 電泳用緩沖液（ ， ） 人血清 水平臺，水平儀 1烘箱 1電泳槽 1電泳儀 1微量注射器 【 實驗步驟 】 瓊脂糖凝膠板的制備和電泳 將 %瓊脂糖凝膠水浴加熱溶化，取 2ml溶化的凝膠液平澆于一潔凈的載玻片上。 6 式中： V對照為滴定對照所消耗的標(biāo)準(zhǔn) Na2S2O3溶液的體積，以 ml為單位； V樣品為滴定對樣品消耗的標(biāo)準(zhǔn) Na2S2O3溶液的體積，以 ml為單位； CNa2S2O3為標(biāo)準(zhǔn) Na2S2O3溶液的濃度（ mol/L）。反應(yīng)式如下： 2NaOH+I2→NaIO+NaI+H 2O CH3COCH3+3NaOI→CHI 3+CH3COONa+2NaOH 剩余的碘，可用標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉滴定。 【 實驗原理 】 根據(jù) β氧化學(xué)說，機體組織能將脂肪酸氧化生成乙酰輔酶 A。由所用染科的體積計算出 1m1染料相當(dāng)于多少 mg抗壞血酸。如此反復(fù) 2— 3次。 2． 1％草酸溶液：溶 1g草酸于 100 ml蒸餾水。 2. 進(jìn)一步熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技能。向第 l支試管中加入 l%氯化鈉溶液 l毫升，向第 2支試管中加入 %的硫酸銅溶液 l毫升，向第 3支試管中加入蒸餾水 l毫升作對照。 (2) 稀釋：將酶提取液用水定容至 100mL。其活性受到很多因素的影響，如溫度、 pH值以及抑制劑激活劑等。 【 實驗原理 】 膽固醇及其酯在硫酸存在下與鄰苯二甲醛作用，產(chǎn)生紫紅色物質(zhì)，此物質(zhì)對 550nm波長的光有最大吸收，可用比色法定量測定。 m＝ A1 C0247。再加入 25%（ V/V）硫酸150ml，置暗處至次日，用空氣將剩余的溴趕去，加入冰乙酸 75ml，搖勻，加蒸餾水稀釋至 1000ml，貯存于 棕色瓶中。 （ 2）標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液 用移液管吸取 1%葡萄糖母液，放入 100ml容量瓶內(nèi)，然后定容至刻度。 （ 5）將上步得沉淀溶于 ，然后以線狀徐徐加入 2倍 95%乙醇，邊加邊攪， 取出絲狀 DNA，依次用 70%、80%、 95%及無水乙醇各洗一次，真空干燥。 （ 2）向上述沉淀物加入 mol/／ＬEDTA溶液，使總體積為 44ml，然后滴加 25%SDS溶液3ml，邊加邊攪拌。 6 ． ． 15mol／Ｌ檸檬酸三鈉溶液 : 氯化 鈉 ,稀釋至 1,000ml。 將抽提的核蛋白用 SDS(十二烷基硫酸鈉 )處理， DNA(或 RNA)即與蛋白質(zhì)分開，可用氯仿 異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去，而 DNA則溶解于溶液中。 10．電泳槽內(nèi)緩沖液可以多次使用。 3．點樣應(yīng)細(xì)窄、均勻、集中。 【 實驗原理 】 血清中各種蛋白質(zhì)的等電點不同，在 妥緩沖液中，各種蛋白質(zhì)所帶的凈電荷量不相等，加上蛋白質(zhì)分子大小不相同，在電場中移動的速度就不等，例如，白蛋白等電點比其他蛋白質(zhì)低，在 電荷比其他蛋白質(zhì)多，加上白蛋白的分子較小，因此在電場中比其他蛋白質(zhì)移動速度快。 【 注意事項 】 如果測定的要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入 520min內(nèi)測 定吸光度，在這段時間內(nèi)樣色很穩(wěn)定。此反應(yīng)反復(fù)性好精度高，線性關(guān)系好。 (4) 點樣斑點不能太大（其直徑應(yīng)小于 ），防止氨基酸斑點重復(fù)；吹風(fēng)溫度不宜過高，否則斑點變黃。 將培養(yǎng)皿中放入 2／ 3量的展層劑，放入層析缸中，然后將濾紙直立于層析缸的培養(yǎng)皿中，樣品端向下垂直放置，切勿使展層劑浸到樣品點，開始層析。 層析缸（ 2）。一般來說，在相同的條件下，每種物質(zhì)都有其固定的 Rf 值。 【 實驗原理 】 紙上層析法是分配層析法中的一種，常以濾紙為惰性支持物。 目 錄 ? 實驗一 氨基酸的分離鑒定 —— 紙層析法 (操作性 ) 4學(xué)時 ? 實驗二 考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測定蛋白質(zhì)濃度 (操作性 ) 3學(xué)時 ? 實驗三 血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳 (驗證性 ) 5學(xué)時 ? 實驗四 動物肝肝臟 DNA的分離與鑒定 (操作性 ) 3學(xué)時 ? 實驗五 血液中葡萄糖的測定 (操作性 ) 3學(xué)時 ? 實驗六 血清中總膽固醇的測定 (操作性 ) 4學(xué)時 ? 實驗七 唾液淀粉酶活性的觀察 (綜合性 ) 4學(xué)時 ? 實驗八 維生素 C的定量測定 (操作性 ) 4學(xué)時 ? 實驗九 脂肪酸的 β氧化 (操作性 ) 4學(xué)時 ? 實驗十 瓊脂糖膠電泳法分離乳酸脫氫同工酶 (操作性 ) 4學(xué)時 ? 實驗十一 酪蛋白的制備 (操作性 ) 4學(xué)時 ? 實驗十二 肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測定 (綜合性 ) 3學(xué)時 實驗一 氨基酸的分離鑒定 —— 紙層析法 【 實驗?zāi)康?】 。由于濾紙纖維素上的羥基和水分子有較大的親和力，而與有機溶劑的親和力相對較弱，因此我們認(rèn)為水相為固定相，有機溶劑相為移動相。 濾紙。 2．點樣 在每個圈下用鉛筆記上每種氨基酸的代號（混合樣可寫 M），然后用毛細(xì)管吸取樣品，輕輕地點到相應(yīng)的氨基酸圈內(nèi)，待晾干或用冷風(fēng)吹干后再點 1次。 【 注意事項 】 (1)在整個操作過程中，手只能接觸濾紙 邊緣 ，否則手指上的氨基酸會造成濾紙上眾多斑點。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后有紅色 棕黑色和藍(lán)色形式，最大光吸收由 465nm變成 595nm，測定 595 nm吸光的增加量，可以測定與其結(jié)合的蛋白質(zhì)的量。以A595為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)年濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （ 2）要求在半天內(nèi)測定 60個樣品。 【 實驗步驟 】 1．薄膜準(zhǔn)備 2．點樣 3．電泳 4．染色和漂洗 5．薄膜和透明 6．定量 （ 1）洗脫法 注意！白蛋白因加入 NaOH的量比其他管多，其光密度值應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)，得到數(shù)值再代入上式中計算。 7．選擇合適的緩沖液離子強度。 【 實驗原理 】 在濃氯化鈉 (12mol/L)溶液中，脫氧核糖蛋白的溶解度很大，核糖蛋白的溶解很小。 3． 25％ SDS溶液：溶 25g十二烷基硫酸鈉于 100ml 45％乙醇。 11 ． 實驗材料與儀器 大白鼠肝臟、勻漿器、離心機 5000r/min、量筒 50ml( 1)、 25ml( 1)、 10ml( 1)、吸管 5ml( 2)、水浴鍋、真空干燥器。 （ 4）將 DNA粗品置于 檸檬酸三鈉溶液中，再加入 ，攪勻，加入一倍體積氯仿 異戊醇混合液，振搖 10min，離心 (4000r /min， 10min)，傾出上層液 (沉淀棄去 )，加入 95%乙醇， DNA即沉淀析出。 血液中的葡萄糖與堿性硫酸銅溶液共熱，銅離子即被血液中的葡萄糖還原成氧化亞銅，后者又可使鉬酸試劑還原成低價的鉬藍(lán)（藍(lán)色）。該混合液在 4℃ 冰箱里可保存數(shù)日，如果暴露于陽光下，數(shù)小時即失效。第三只血糖管中加 2ml蒸餾水。如血