【正文】 《 生物化學實驗 》 課程簡介 生物化學課程是一門與生物技術相關的專業(yè)基礎必修課，本實驗課程是附屬于該課程的一個教學環(huán)節(jié)，開設操作性、驗證性、綜合性等實驗項目，實驗內容主要進行生物分子（蛋白質、核酸、糖、維生素）的定性、定量測定和分離提取制備，學習酶活性和維生素的測定方法等實驗，涉及了生物化學的基本實驗技術及典型儀器設備。通過實驗有助于學生加深對生物化學的基本知識和基本理論的理解，掌握生物化學的主要方法與技術，包括經典的、常規(guī)的、以及現(xiàn)代的方法與技術。 目 錄 ? 實驗一 氨基酸的分離鑒定 —— 紙層析法 (操作性 ) 4學時 ? 實驗二 考馬斯亮藍結合法測定蛋白質濃度 (操作性 ) 3學時 ? 實驗三 血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳 (驗證性 ) 5學時 ? 實驗四 動物肝肝臟 DNA的分離與鑒定 (操作性 ) 3學時 ? 實驗五 血液中葡萄糖的測定 (操作性 ) 3學時 ? 實驗六 血清中總膽固醇的測定 (操作性 ) 4學時 ? 實驗七 唾液淀粉酶活性的觀察 (綜合性 ) 4學時 ? 實驗八 維生素 C的定量測定 (操作性 ) 4學時 ? 實驗九 脂肪酸的 β氧化 (操作性 ) 4學時 ? 實驗十 瓊脂糖膠電泳法分離乳酸脫氫同工酶 (操作性 ) 4學時 ? 實驗十一 酪蛋白的制備 (操作性 ) 4學時 ? 實驗十二 肝臟谷丙轉氨酶活力測定 (綜合性 ) 3學時 實驗一 氨基酸的分離鑒定 —— 紙層析法 【 實驗目的 】 。 。 。 【 實驗原理 】 紙上層析法是分配層析法中的一種，常以濾紙為惰性支持物。紙上層析法是分離、鑒定和定量測定氨基酸、糖類、抗生素等有機物質的一項重要而簡便的分析方法。所用設備簡單、操作方便，使用樣品少，分離效果好，為近 代生物化學分析中重要技術之一。此法廣泛地應用于科研和生產分析工作中。 紙上層析的原理：常以水和有機溶劑作為展層劑；水和有機溶劑互溶后形成兩個相：一個是飽和了有機溶劑后的水相，一個是飽和了水后的有機溶劑相。由于濾紙纖維素上的羥基和水分子有較大的親和力，而與有機溶劑的親和力相對較弱，因此我們認為水相為固定相，有機溶劑相為移動相。由于物質的極性大小不同，在兩相中分配比例有所差異。極性小的物質在有機相中分配較多，隨有機相移動較快；而極性大的物質在水相中分配較多，移動相對較慢，從而將極性不同的物質分開。一般來說，在相同的條件下，每種物質都有其固定的 Rf 值。 Rf值的定義為： Rf =(原點到層析斑點中心的距離 )/（原點到溶劑前沿的距離） 用紙層析鑒定樣品時，一般都與標準品相比較。若沒有標準品，可選擇文獻記載的該物質層析條件，根據文獻 Rf值進行鑒定 。 【 實驗試劑與器材 】 溶劑系統(tǒng) （ 1）堿相溶劑： 正丁醇 :12%氨水 :95%乙醇＝ 13:3:3（體積比） （ 2）酸相溶劑： 正丁醇 :80%甲酸 :水＝ 15:3:2（體積比） 顯色貯備液： %水合茚三酮丙酮溶液 V（ %硫酸銅） :V（ 75%乙醇） =2:38溶液。 混合氨基酸溶液 6mg/ml。 濾紙。 燒杯 10ml（ 1）。 剪刀。 層析缸（ 2）。 微量注射器 10μl （ 1）或毛細管。 電吹風（ 1）。 1 722型（或 7220型）分光光度計。 【 實驗步驟 】 1．紙的處理 取 18 cm長、 18 cm寬的濾紙一張，離底邊 2 cm處用鉛筆輕輕劃一條與底邊平行的線，并等距離的在線上定點樣點 (原點 )劃圈，使圈的直徑小于 cm。 2．點樣 在每個圈下用鉛筆記上每種氨基酸的代號（混合樣可寫 M），然后用毛細管吸取樣品，輕輕地點到相應的氨基酸圈內，待晾干或用冷風吹干后再點 1次。每個樣品共點 2次。 3．層析 將點好樣的濾紙縱向卷起來，點樣面向里，點樣點 位于一端，用針線縫成筒狀，不要使濾紙兩邊接觸 (見圖1)。 將培養(yǎng)皿中放入 2／ 3量的展層劑，放入層析缸中，然后將濾紙直立于層析缸的培養(yǎng)皿中，樣品端向下垂直放置，切勿使展層劑浸到樣品點，開始層析。 當溶劑前沿到達離上端 2 cm處，取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿，晾干。 圖 1 濾紙的縫合 4．顯色 用噴霧器向濾紙上均勻噴灑 %茚三酮，晾干后，將濾紙放入烘箱中 (80100℃ )，烘烤 5分鐘后，濾紙上即顯出紫紅色的氨基酸斑點。用鉛筆描出斑點輪廓 (見圖 2)。 圖 1．原點； 2．層析點； 3．溶劑前沿 5 ．計算 用尺量出原點到斑點中心距離以及原點到溶劑前沿距離，計算各標準氨基酸和混合氨基酸的 Rf值。 【 注意事項 】 (1)在整個操作過程中，手只能接觸濾紙 邊緣 ，否則手指上的氨基酸會造成濾紙上眾多斑點。 (2)在 點樣時，不要將毛細管插錯了試劑瓶 。 (3)展層結束后，切 勿忘記 用鉛筆描出溶劑前沿。 (4) 點樣斑點不能太大（其直徑應小于 ），防止氨基酸斑點重復；吹風溫度不宜過高，否則斑點變黃。 (5)根據目的、要求，選擇合適溶劑系統(tǒng)。 實驗二 考馬斯亮藍結合法測定蛋白質濃度 【 實驗目的 】 學習考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度的原理和方法。 【 實驗原理 】 考馬斯亮藍測定蛋白質含量是利用蛋白質 染料結合法的原理，定量測定微量蛋白質濃度快速、靈敏的方法。 考馬斯亮藍 G250存在著兩種不同樣色形式，紅色 棕黑色和藍色。染料與蛋白質結合后有紅色 棕黑色和藍色形式，最大光吸收由 465nm變成 595nm，測定 595 nm吸光的增加量，可以測定與其結合的蛋白質的量。 蛋白質與染料結合速度很快， 2min就可以反應完全，并可以穩(wěn)定 1h，蛋白質 染料復合物有很大的消光系數(shù)，使得測定蛋白質濃度是靈敏度很高。測定范圍為 10100μg蛋白質，微量測定時達到 110μg蛋白質。此反應反復性好精度高，線性關系好。 【 實驗試劑與器材 】 標準蛋白液（ ） %NaCl 稀釋到 2022ml。 %NaCl 考馬斯亮藍試劑： 100mg考馬斯亮藍 G250溶于 50ml 5%乙醇中，加 100ml85%磷酸，蒸餾水稀釋 1000ml，濾紙過濾。 待測蛋白：人血清，用前用 %NaCl稀釋 200倍。 漩渦混合器 移液管 （ 2）， （ 2）， 5ml（ 1） 分光光度計 試管 15cm ( 8) 量筒 100ml( 1) 電子分析天平 1試管架 ( 1) 【 實驗步驟 】 一、標準曲線線的繪制 取 7支干凈試管，按下表進行編號并加入試劑。以A595為縱坐標，標準蛋白質年濃度為橫坐標，繪制標準曲線。 試管號 試劑 1 2 3 4 5 6 1mg/ml標準蛋白液 /ml NaCl/ml 1 考馬斯亮藍染液 /ml 搖勻， 1小時內以 1號管為空白對照，在 595nm處比色 A595nm 二、未知樣液的測定 另取一干凈試管，加入樣品 ，混勻，室溫靜置 3min，于波長 595nm處比色，讀取吸光度