綠色熒光蛋白(gfp)基因的克隆、表達(dá)和粗提取-資料下載頁(yè)
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【正文】 . Science, 1994, 263(5148) : 802[5] ChalfieM. Green fluorescent p rotein. Photochem Photobiol, 1995, 62 (4) : 651[6] Larrick JW, Balint RF, Youvan DC. Green fluorescent protein: untapped potential in immunotechnology. Immunotechnology, 1995, 1 (2) : 83[7] 薩姆布魯克 J，弗里奇 E F，曼尼阿蒂斯 T. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]. 金冬雁，黎孟楓，譯. 2版. 北京：科學(xué)出版，1995. [8] 杜禎, 馬海利, 中國(guó)畜牧獸醫(yī),2007 年第34卷第5期[9] Nuc P. Nuc K. Rebinant protein production in Escherichia coli[J].Postepy Biochem,2006,52 (4):448456.[10] Dong X,Tang B,Li J,et and Purification of Intact and Functional Soybean (Glycine max)Seed Ferritin Complex in Escherichia coli [J].J Microbiol Biotechnol,2008,18 (2):299307.[11] 呂素芳，劉崢，郭廣君，蔡永萍，邱德文 大腸桿菌中表達(dá)外源重組蛋白的研究 [12] 魏春紅，李毅主編 原核細(xì)胞中外源基因的表達(dá)和初步純化，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，高等教育出版社，:9597附 錄1 LB培養(yǎng)基的配制：組成液體固體蛋白胨（Trypton）10g10g酵母提取物（Yeast Extract）5g5gNaCl10g10g瓊脂（Agar）15g蒸餾水定容至1000ml定容至1000ml2. 溶液Ⅰ： 50mM 葡萄糖 25mM TrisHCl（） 10mM EDTA3. 溶液Ⅱ（現(xiàn)用現(xiàn)配）： NaOH 1% SDS （先加水，再加NaOH和SDS）4. 溶液Ⅲ（100ml）：5M KAc 60ml 冰醋酸 5. DNasefree RNase A：溶解RNase A于TE緩沖液中，濃度為10mg/ml，煮沸1030min，除去DNase活性，20℃貯存。（）[10mM TrisHCl；1mM EDTA]的配制：藥品名稱(chēng)1M TrisHCl（）10ml1ml EDTA2mlddH2O定容至1000ml定容至100ml7. 20TBE：216g Tris堿，110g硼酸，80ml EDTA（），定容至1000ml。8. GeneFinder溴酚藍(lán)上樣緩沖液6loading buffer：%溴酚蘭，%二甲苯青FF，40%（w/v）蔗糖水溶液。配制好后可以按50：1的比例稀釋GeneFinder。9．PEGFPN3質(zhì)粒全圖譜實(shí)驗(yàn)使用的EGFP蛋白取自原核真核穿梭質(zhì)粒pEGFPNB3B的蛋白質(zhì)編碼序列。此質(zhì)粒原本被設(shè)計(jì)于在原核系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增，并可在真核哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。本質(zhì)粒主要包括位于PCMV真核啟動(dòng)子與SV40 真核多聚腺苷酸尾部之間的EGFP編碼序列與位于EGFP上游的多克隆位點(diǎn)；一個(gè)由SV40 早期啟動(dòng)子啟動(dòng)的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的細(xì)菌啟動(dòng)子可啟動(dòng)在原核系統(tǒng)中的復(fù)制與卡那抗性。在EGFP編碼序列上下游，存在特異的BamH I及Not I限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，可切下整段EGFP編碼序列。10．pET28a質(zhì)粒全圖譜表達(dá)EGFP 蛋白使用的pET28 原核載體包含有在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的Histag polyHis 編碼序列；用于表達(dá)蛋白的T7 啟動(dòng)子，T7 轉(zhuǎn)錄起始物以及T7 終止子；選擇性篩選使用的lacI 編碼序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 啟動(dòng)子，以及為產(chǎn)生單鏈DNA 產(chǎn)物的f1 啟動(dòng)子。19
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