綠色熒光蛋白(gfp)基因的克隆、表達和粗提取-展示頁
2024-08-20 15:37本頁面
【正文】 中的基因克隆與重組表達，以及對其進行粗提取。 方法： DH5ɑ中用堿提取質(zhì)粒的方法提取質(zhì)粒pEGFPN3和質(zhì)粒pET28a。再用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI對成功提取的質(zhì)粒進行酶切，并對酶切后的質(zhì)粒進行瓊脂糖凝膠電泳，用以確定已經(jīng)提取了GFP基因。用IPTG誘導GFP基因表達可以看到淺綠色菌落。 結(jié)論：本實驗有助于學生掌握最基本的分子生物學實驗技術，為進一步的實驗奠定基礎。當受到紫外或藍光激發(fā)時，GFP 發(fā)射綠色熒光。1962 年，下村修等分離純化了水母中發(fā)光蛋白水母素，并發(fā)現(xiàn)一種綠色的熒光蛋白。近年來廣泛用于基因的表達與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移以及相互作用、信號傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化，以及細胞的分離與純化等研究領域[ 2～3] 。采用基因工程手段生產(chǎn)GFP標記的方法，可建立一種簡便、快速的免疫診斷技術[6] 。目前，感受態(tài)細胞的制備主要采用CaCl2 法，該方法操作簡單、容易掌握、重復性好、轉(zhuǎn)化率高，可廣泛應用于一般的實驗室。大腸桿菌是第一個用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌，它不僅具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導效率高、生長繁殖快、成本低廉、可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點[9]。大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前最常用的外源蛋白表達系統(tǒng),大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作,以及有大量可供選擇的克隆或表達載體,使之成為人們克隆表達外源基因的主要菌株[11]。在原核細胞中表達蛋白質(zhì)的載體常用啟動子有T7啟動子、Trp啟動子色氨酸啟動子、Tac啟動子、T7噬菌體中基因10 的啟動子及Lac啟動子等。根據(jù)原核生物基因表達特點選擇載體進行目的基因克隆，然后轉(zhuǎn)入相應的菌種中表達目的蛋白質(zhì)[12]。通過質(zhì)粒重組形成所需要的重組質(zhì)粒pET28aGFP，將重組質(zhì)粒導入大腸桿菌體內(nèi)，通過酶切及用IPTG誘導檢測是否在大腸桿菌體內(nèi)誘導表達成功。2 實驗目的學會綠色熒光蛋白基因表達載體的構建及在大腸桿菌中的表達整個過程中的每一步，掌握其方法。① 學會最常用的小量制備質(zhì)粒DNA的堿裂解方法② 學會常用的DNA瓊脂糖凝膠電泳技術③學會用限制性內(nèi)切酶切割DNA④學會用瓊脂糖凝膠中回收DNA片段⑤學會DNA片段的體外連接技術⑥學會用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞⑦學會用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)受體菌的基本操作技術⑧學會用酶切法篩選重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功的克隆菌⑨了解外源基因在原核細胞中表達的特點和IPTG誘導表達的方法⑩學習SDSPAGE膠的基本灌制方法和用SDSPAGE檢測表達蛋白3 實驗設備恒溫培養(yǎng)箱，超凈臺，恒溫搖床，制冰機，臺式離心機，核酸電泳儀，小型混合器，冰箱，藍盾可見光透射儀，移液器、電泳槽、振蕩器、制冰機、凝膠成像儀，水浴鍋，高壓滅菌鍋、振蕩培養(yǎng)箱，手持式紫外燈。5 實驗操作步驟 操作流程（pET28ɑ）（pEGFP－N3）質(zhì)粒 提取 質(zhì)粒 提取質(zhì)粒pEGFP－N3質(zhì)粒pET28ɑ酶切 回收 酶切 回收載體片段插入片段連 接重組質(zhì)粒(pET28ɑGFP)轉(zhuǎn) 化BL21(pET28ɑGFP)誘 導綠色熒光蛋白（粗提取）圖一 流程圖 質(zhì)粒DNA的分離與純化 質(zhì)粒的培養(yǎng)1）在含有pEGFP－N3質(zhì)粒的DH5α平板上菌落上挑取菌種，置于含有5mL LB培養(yǎng)基的試管中。 2）有pET28a質(zhì)粒的平板上挑取單菌落于另外一個試管中，同樣搖蕩培養(yǎng)過夜。2）重復1。 4）菌體沉淀重懸浮于100μL溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置10min。 6）加入150μL預冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩3次,使沉淀混勻,冰浴中15分鐘,13000rpm離心5min。 8）將水相移入干凈eppendorf 管中,加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)振蕩混勻, 13000rpm離心2min。 10）棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1mL 70％乙醇洗沉淀一次, 振蕩混勻后，13000rpm離心5min。 12）將沉淀溶于30μL TE緩沖液(，含20μg/mL RNaseA)中，保存在20℃冰箱中。 質(zhì)粒DNA的鑒定與純化1) 1%瓊脂糖凝膠的配制①加20ml 1TBE緩沖液于三角瓶中，②，于微波爐中加熱至完全熔化，
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