基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)-資料下載頁(yè)
2025-05-26 06:00本頁(yè)面
【正文】 從而抑制引物的形成。 因此， rom基因的缺失或 RNAI基因的突變，都會(huì)引起質(zhì)粒拷貝數(shù)的增加。 （ 2）質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響 質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性是指質(zhì)粒缺陷性分配引起的質(zhì)粒丟失現(xiàn)象。 天然質(zhì)粒都可以穩(wěn)定地保持在寄主細(xì)胞內(nèi)，這是由于它們具有一段 分配功能區(qū) Par所致。分配功能區(qū) Par能夠保證質(zhì)粒分子在每次細(xì)胞周期中都能準(zhǔn)確地分離，并均勻地分配到子細(xì)胞中去。 克服質(zhì)粒丟失的方法： 1）將 Par克隆到表達(dá)載體； 2）對(duì)無質(zhì)粒細(xì)胞進(jìn)行反選擇。 大體步驟為：使攜帶目的基因的質(zhì)粒同時(shí)帶上編碼 ?啟動(dòng)子的 ?cl基因，形成特殊的重組質(zhì)粒。然后用一種啟動(dòng)子缺陷的 ?突變體感染攜帶這種重組體質(zhì)粒的大腸桿菌寄主細(xì)胞，使之成為溶源性細(xì)菌。在這種溶源性細(xì)菌中，重組質(zhì)粒的喪失，伴隨著發(fā)生 ?阻遏物的喪失，則原噬菌體便被誘發(fā)進(jìn)入溶菌生長(zhǎng)周期，從而使寄主細(xì)胞裂解死亡。 mRNA轉(zhuǎn)錄本的分子特性對(duì)基因表達(dá)效率的影響 （ 1）翻譯起始系列對(duì)表達(dá)效率的影響 許多細(xì)菌基因起始密碼子 5’上游都存在 5—10個(gè)核苷酸的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ RBS），特稱為 SD序列 。它包含 5’UAAGGAGG3’的全部或其中一部分。 ※ 已經(jīng)鑒定出 SD序列與 16S rRNA分子之間的堿基互補(bǔ)程度，可明顯地影響 mRNA的翻譯速率。當(dāng)此序列為 5’GGAGG3’時(shí)，可與 16S rRNA 3’端區(qū)段完全互補(bǔ)，翻譯效率最高；而當(dāng)該序列發(fā)生單堿基突變時(shí)，翻譯效率便下降 30倍之多。 ※ 連接在 SD序列后面的 4個(gè)堿基成分的改變，會(huì)對(duì)翻譯效率發(fā)生很大影響。 如果這個(gè)區(qū)域是由 4個(gè) A或 4個(gè) T堿基組成，其翻譯最有效；而當(dāng)是由 4個(gè) C或 4個(gè)G堿基組成，翻譯效率則只及最高翻譯效率的 50%或 25%。 ※ 直接位于起始密碼 AUG上游的三個(gè)堿基的三聯(lián)體組成，同樣也對(duì)翻譯效率發(fā)生影響。 以 ?半乳糖苷酶 mRNA的翻譯為例，當(dāng)這三聯(lián)體組分為 UAU或CUU時(shí)，翻譯效率最高；而如果是 UUC、 UCA或AGG時(shí)，翻譯水平下降 20倍。 (2) mRNA的穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響 mRNA的 穩(wěn)定性 是指 mRNA分子的相對(duì)壽命，或?qū)?nèi)源 RNase降解作用的抵抗能力。 在細(xì)菌細(xì)胞中，有兩類不同的核糖核酸酶參與 mRNA降解作用：核糖核酸內(nèi)切酶（ RNaseE、 RNaseK和RNaseIII）和核糖核酸外切酶（ RNaseII和 PNPase—polynucleotide phosphorylase）。 在不同種類的細(xì)菌中，這些核糖核酸酶的含量比例不同。例如，在大腸桿菌細(xì)胞中， 90%的外切核酸酶是RNaseII；而在枯草桿菌細(xì)胞中，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的外切核酸酶是 PNPase 為了維護(hù)自身的穩(wěn)定性， mRNA 分子在進(jìn)化過程中也形成了兩種保護(hù)性結(jié)構(gòu)元件： 5’UTR系列和 3’UTR系列 以及 順反子間區(qū)（ intercistronic region）的莖環(huán)結(jié)構(gòu) 。 ※ 將大腸桿菌 mRNA分子的某些保護(hù)性結(jié)構(gòu)元件與外源 mRNA融合，便可起到穩(wěn)定劑的作用。 遺傳密碼子的使用對(duì)基因表達(dá)效率的影響 （ 1）密碼子使用的偏愛性 遺傳密碼有簡(jiǎn)并性，即一種氨基酸有數(shù)個(gè)同義密碼子；例如，亮氨酸共有 6個(gè)密碼子。 無論真核基因還是原核基因，一種特定的氨基酸并不是以同等頻率使用所有的同義密碼子，而主要使用其中的某一兩種。這種遺傳密碼使用的非隨機(jī)性現(xiàn)象 ——密碼子使用的偏愛性 。 造成密碼子使用的偏愛性的兩個(gè)原因： 1）細(xì)胞中同工 tRNA的豐度差異； 2）嘧啶堿基結(jié)尾的密碼子（ C或 U）之間的非隨機(jī)選擇。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，密碼子第 3位結(jié)尾的嘧啶堿基在使用上是非隨機(jī)的，存在著偏愛性，且這種偏愛性與基因的表現(xiàn)度有關(guān)。對(duì)于具高表達(dá)活性的基因，如果密碼子的頭兩個(gè)堿基是 AA或 UU，則其第三位堿基偏向選用 C，而如果頭兩個(gè)堿基是 GG或 CC，則其第三個(gè)堿基偏向選用 U。 3） 堿基含量（ AT/GC） （ 2）密碼子使用的偏愛性對(duì)基因表達(dá)效率的影響 ** 富含大腸桿菌罕見密碼子的外源真核基因是很難在大腸桿菌細(xì)胞中得到有效的表達(dá)。反之，則表達(dá)效率提高。 ** 到底多少含量的罕見密碼子才不會(huì)給克隆在大腸桿菌的外源基因的表達(dá)造成負(fù)面影響？ 機(jī)制還不明確。 寄主細(xì)胞的生理狀態(tài)對(duì)基因表達(dá)的影響 大腸桿菌的生理狀態(tài)會(huì)或多或少地影響外源基因的表達(dá)效率；但究竟是怎樣影響外源基因的表達(dá)效率，仍缺乏全面系統(tǒng)的研究。 影響大腸桿菌生理狀態(tài)的因素：包括培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分、細(xì)胞培養(yǎng)方式、以及培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基中所溶解的氧等。
環(huán)評(píng)公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1