基因工程3大腸桿菌表達系統(tǒng)-資料下載頁
2025-05-26 06:00本頁面
【正文】 從而抑制引物的形成。 因此， rom基因的缺失或 RNAI基因的突變，都會引起質(zhì)?？截悢?shù)的增加。 （ 2）質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性對表達效率的影響 質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性是指質(zhì)粒缺陷性分配引起的質(zhì)粒丟失現(xiàn)象。 天然質(zhì)粒都可以穩(wěn)定地保持在寄主細胞內(nèi)，這是由于它們具有一段 分配功能區(qū) Par所致。分配功能區(qū) Par能夠保證質(zhì)粒分子在每次細胞周期中都能準確地分離，并均勻地分配到子細胞中去。 克服質(zhì)粒丟失的方法： 1）將 Par克隆到表達載體； 2）對無質(zhì)粒細胞進行反選擇。 大體步驟為：使攜帶目的基因的質(zhì)粒同時帶上編碼 ?啟動子的 ?cl基因，形成特殊的重組質(zhì)粒。然后用一種啟動子缺陷的 ?突變體感染攜帶這種重組體質(zhì)粒的大腸桿菌寄主細胞，使之成為溶源性細菌。在這種溶源性細菌中，重組質(zhì)粒的喪失，伴隨著發(fā)生 ?阻遏物的喪失，則原噬菌體便被誘發(fā)進入溶菌生長周期，從而使寄主細胞裂解死亡。 mRNA轉(zhuǎn)錄本的分子特性對基因表達效率的影響 （ 1）翻譯起始系列對表達效率的影響 許多細菌基因起始密碼子 5’上游都存在 5—10個核苷酸的核糖體結(jié)合位點（ RBS），特稱為 SD序列 。它包含 5’UAAGGAGG3’的全部或其中一部分。 ※ 已經(jīng)鑒定出 SD序列與 16S rRNA分子之間的堿基互補程度，可明顯地影響 mRNA的翻譯速率。當此序列為 5’GGAGG3’時，可與 16S rRNA 3’端區(qū)段完全互補，翻譯效率最高；而當該序列發(fā)生單堿基突變時，翻譯效率便下降 30倍之多。 ※ 連接在 SD序列后面的 4個堿基成分的改變，會對翻譯效率發(fā)生很大影響。 如果這個區(qū)域是由 4個 A或 4個 T堿基組成，其翻譯最有效；而當是由 4個 C或 4個G堿基組成，翻譯效率則只及最高翻譯效率的 50%或 25%。 ※ 直接位于起始密碼 AUG上游的三個堿基的三聯(lián)體組成，同樣也對翻譯效率發(fā)生影響。 以 ?半乳糖苷酶 mRNA的翻譯為例，當這三聯(lián)體組分為 UAU或CUU時，翻譯效率最高；而如果是 UUC、 UCA或AGG時，翻譯水平下降 20倍。 (2) mRNA的穩(wěn)定性對表達效率的影響 mRNA的 穩(wěn)定性 是指 mRNA分子的相對壽命，或?qū)?nèi)源 RNase降解作用的抵抗能力。 在細菌細胞中，有兩類不同的核糖核酸酶參與 mRNA降解作用：核糖核酸內(nèi)切酶（ RNaseE、 RNaseK和RNaseIII）和核糖核酸外切酶（ RNaseII和 PNPase—polynucleotide phosphorylase）。 在不同種類的細菌中，這些核糖核酸酶的含量比例不同。例如，在大腸桿菌細胞中， 90%的外切核酸酶是RNaseII；而在枯草桿菌細胞中，占絕對優(yōu)勢的外切核酸酶是 PNPase 為了維護自身的穩(wěn)定性， mRNA 分子在進化過程中也形成了兩種保護性結(jié)構(gòu)元件： 5’UTR系列和 3’UTR系列 以及 順反子間區(qū)（ intercistronic region）的莖環(huán)結(jié)構(gòu) 。 ※ 將大腸桿菌 mRNA分子的某些保護性結(jié)構(gòu)元件與外源 mRNA融合，便可起到穩(wěn)定劑的作用。 遺傳密碼子的使用對基因表達效率的影響 （ 1）密碼子使用的偏愛性 遺傳密碼有簡并性，即一種氨基酸有數(shù)個同義密碼子；例如，亮氨酸共有 6個密碼子。 無論真核基因還是原核基因，一種特定的氨基酸并不是以同等頻率使用所有的同義密碼子，而主要使用其中的某一兩種。這種遺傳密碼使用的非隨機性現(xiàn)象 ——密碼子使用的偏愛性 。 造成密碼子使用的偏愛性的兩個原因： 1）細胞中同工 tRNA的豐度差異； 2）嘧啶堿基結(jié)尾的密碼子（ C或 U）之間的非隨機選擇。 實驗發(fā)現(xiàn)，密碼子第 3位結(jié)尾的嘧啶堿基在使用上是非隨機的，存在著偏愛性，且這種偏愛性與基因的表現(xiàn)度有關(guān)。對于具高表達活性的基因，如果密碼子的頭兩個堿基是 AA或 UU，則其第三位堿基偏向選用 C，而如果頭兩個堿基是 GG或 CC，則其第三個堿基偏向選用 U。 3） 堿基含量（ AT/GC） （ 2）密碼子使用的偏愛性對基因表達效率的影響 ** 富含大腸桿菌罕見密碼子的外源真核基因是很難在大腸桿菌細胞中得到有效的表達。反之，則表達效率提高。 ** 到底多少含量的罕見密碼子才不會給克隆在大腸桿菌的外源基因的表達造成負面影響？ 機制還不明確。 寄主細胞的生理狀態(tài)對基因表達的影響 大腸桿菌的生理狀態(tài)會或多或少地影響外源基因的表達效率；但究竟是怎樣影響外源基因的表達效率，仍缺乏全面系統(tǒng)的研究。 影響大腸桿菌生理狀態(tài)的因素：包括培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、細胞培養(yǎng)方式、以及培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基中所溶解的氧等。
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