基因工程3大腸桿菌表達系統(tǒng)(已修改)
2025-06-07 06:00 本頁面
【正文】 前言 ?基因表達是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。 ?基因工程主要目標之一是生產(chǎn)常規(guī)方法難以生產(chǎn)的大量蛋白質(zhì)產(chǎn)物 — 即實現(xiàn)基因的高效表達。 ?基因高效表達研究是指外源基因在某種細胞中的表達活動，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個基因表達體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達產(chǎn)物。 第三章 真核基因在大腸桿菌中的表達 最佳的基因表達體系： ⑴目的基因的表達產(chǎn)量高 。 ⑵ 表達產(chǎn)物穩(wěn)定 。 ⑶ 生物活性高 。 ⑷ 表達產(chǎn)物容易分離純化。 第一節(jié)基因的表達系統(tǒng)與表達策略 宿主細胞的選擇 適合目的基因表達的宿主細胞的要求 : 容易獲得較高濃度的細胞； 能利用易得廉價原料； 不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素； 發(fā)熱量低、需氧低、適當?shù)陌l(fā)酵溫度和細胞形態(tài)； 容易進行代謝調(diào)控； 容易進行 DNA重組技術(shù)操作； 產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高， 產(chǎn)物容易提取純化。 宿主細胞分為兩大類： 原核細胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、 鏈霉菌等； 真核細胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。 一、真核基因的大腸桿菌表達體系 目前，已被用于表達外源蛋白質(zhì)的表達系統(tǒng)有細菌（大腸桿菌和枯草桿菌）、酵母、昆蟲、植物和哺乳動物細胞等。但比較而言，大腸桿菌表達系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)越性。 大腸桿菌表達體系的優(yōu)越性 ： 1. 對大腸桿菌的背景知識（完成基因組全測序哦），特別是基因表達調(diào)控的分子機理有（乳糖操縱子）深刻的了解； 2. 是一種安全的基因工程實驗體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體； 3. 許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細胞中實現(xiàn)有效、高水平的表達； 4. 大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，易用于批量生產(chǎn)。 大腸桿菌中表達體系的不足 ： 1. 真核基因，在結(jié)構(gòu)上同原核基因之間存在著很大的差別。 2. 真核基因的轉(zhuǎn)錄信號同原核的不同。 細菌的 RNA聚合酶不能識別真核的啟動子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉(zhuǎn)錄終止信號功能的核苷酸序列。 3. 真核基因 mRNA的分子結(jié)構(gòu)同細菌的有所差異，影響真核基因 mRNA穩(wěn)定性。 4. 許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數(shù)的這類修飾作用在細菌細胞中并不存在； 5. 細菌的蛋白酶，能夠識別外來的真核基因所表達的蛋白質(zhì)分子，并把它們降解掉。 6. 大腸桿菌周質(zhì)內(nèi)存在各種內(nèi)毒素。 克隆基因正確表達的基本條件 最基本條件 ：應(yīng)該能夠進行正常的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯，以及在正常情況下還與轉(zhuǎn)譯后加工及新生多肽在細胞中的分布有關(guān)。 啟動子 、 終止子 以及正確 讀碼框（ ORF） 。 重要條件 ： 編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物應(yīng)能維持正常的穩(wěn)定性。 具有核糖體結(jié)合位點； 具有強啟動子； …… 二、大腸桿菌的表達載體 大腸桿菌表達載體的基本成分 TTGACA。 TATAAT 35 17 10 P R TAAGGAGG（ N） 8 ATG（ 91%） GTG（ 8%） TTG（ 1%） 編碼序列 TAA TGA TAG TT tetr Ori RBS 外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理 ? 啟動子 ? 終止子 ? 核糖體結(jié)合位點 ? 密碼子 ? 質(zhì)?？截悢?shù) 轉(zhuǎn)錄水平 翻譯水平 （ 1）啟動子 要使克隆的外源基因高水平表達的最佳啟動子，必須具備以下幾個條件： 1）必須是一個強啟動子。 2）這個啟動子應(yīng)能呈現(xiàn)一種低限的基礎(chǔ)表達水平。使用高度抑制型的啟動子是一種極為重要的條件。 3）這種啟動子應(yīng)是誘導型的，能通過簡單的方式使用廉價的誘導物而得以誘導，如物理（如熱）和化學（如 IPTG）誘導 。 （ 2）轉(zhuǎn)錄終止子 * 當上游啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄作用通讀過下游啟動子時，便會使該啟動子的功能受到抑制。 —啟動子封堵作用 * 在克隆基因編碼區(qū)的 3’末端接上一個有效的轉(zhuǎn)錄終止子，便能夠阻止轉(zhuǎn)錄通讀。 此外，轉(zhuǎn)錄終止子還能增強 mRNA分子的穩(wěn)定性，從而大大提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平。 （ 3）翻譯起始序列 mRNA轉(zhuǎn)錄本 5’端的獨特的結(jié)構(gòu)特征（核糖體結(jié)合位點， RBS），是決定 mRNA翻譯效率的主要因素。 至今，仍未鑒定出通用有效的翻譯起始序列的保守結(jié)構(gòu)，但卻已經(jīng)發(fā)展出許多種可以用來有效地降低
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