cr技術(shù)及其應(yīng)用ppt課件-資料下載頁
2025-04-29 04:50本頁面
【正文】 2 3二、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA (random amplified polymorphic DNA, RAPD) 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 79 高等真核生物基因組 DNA酶切，連接接頭，然后進(jìn)行選擇性 PCR擴(kuò)增。 Ge n o m ic DN A5 ’ AA T T C T 3 ’ 3 ’ G AA T 5 ’L i g a te a d a p te r s + L i g a se5 ’ CT CGT A G A CT G CGT A CC A A T T C T T A CT CA G G A CT CA T 3 ’ 3 ’ CA T CT G A CGCA T G G T T A A G A A T G A G T CCT G A G T A G CA G 5 ’E co RI a d a p te r M se I a d a p te rA m p l i ca tio n( +n ) A A T G A G T CCT G A G T A G CA G M s e I p r i m e rP r e a m p l i fica tio nE co RI a n d M se I5 ’ CT CGT A G A CT G CGT A CC A A T T C T T A CT CA G G A CT CA T 3 ’ 3 ’ CA T CT G A CGCA T G G T T A A G A A T G A G T CCT G A G T A G CA G 5 ’( +1 to +3 ) A A T G A G T CC T G A G T A G CA GM se I p r i m e r5 ’ CT CGT A G A CT G CGT A CC A A T T C T T A CT CA G G A CT CA T 3 ’ 3 ’ CA T CT G A CGCA T G G T T A A G A A T G A G T CCT G A G T A G CA G 5 ’ E co RI p r i m e r G A CT G CGT A CCA A T T ( +1 to +3 )No s e l e ct i ve b a se s= No P CR p r o d u ct s= l a b e l p r i m e r E co RI p r i m e r G A CT G CGT A CCA A T T ( +n )三、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 (amplified fragment polymorphism, AFLP)： Real— time PCR（或 TaqMan PCR ） 熒光 實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)，是指在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè) PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”，最后通過 Ct值 和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的 DNA (or cDNA) 的起始濃度進(jìn)行定量的方法。 第六節(jié) 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 常規(guī) PCR Process In theory, product accumulation is proportional to 2n, where n is the number of amplification cycle repeats Amplification is exponential, but the exponential increase is limited: A linear increase follows exponential Eventually plateaus 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的定量方式 熒光檢測 PCR儀 ? 在熒光定量 PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念 —Ct值。C代表 Cycle， t代表 threshold， Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 每個(gè)模板的 Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多， Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表 Ct值，因此，只要獲得未知樣品的 Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 熒光標(biāo)記方式 SYBR熒光染料 The intercalation dye begins adding at the Extension the proper wavelength is applied, the fluorescence of bound dyes is very high over background. Sybr Green = 497 nm TaqMan探針 TaqMan探針是一段 5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán) (R), 3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán) (Q)的寡核苷酸 , 其序列與模板 DNA中的一段完全互補(bǔ)。 ? 當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與 3’ 端的淬滅基團(tuán)接近而被淬滅。 ? 但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的 5’ 外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。熒光基團(tuán)便可發(fā)出熒光。 熒光強(qiáng)度與 PCR產(chǎn)物量呈正比關(guān)系 3 發(fā) 夾 型 雜 交 探 針
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