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2025-01-10 08:36本頁面
【正文】 （最好在加完所有其他反應(yīng)成分，包括防止蒸發(fā)用的礦物油后才吸加 模板DNA， 將模板加入微量離心管后，蓋好離心管并用戴有手套的手指輕輕單擊管側(cè)壁，以搖勻液體，再作瞬時(shí)離心 [10秒 ]，使水相和有機(jī)相分開）。 ②加樣器通道易形成氣溶膠，造成加樣器通道污染，可通過使用有濾篩的吸頭避免污染 （將模板 DNA加入 PCR系統(tǒng)時(shí)，注意切勿形成噴霧，后者有可能污染別的反應(yīng)，所有并非即用管都應(yīng)蓋嚴(yán)）。 ③ 打開標(biāo)本管蓋引起樣品飛濺 （ 打開前須瞬間離心 ） ④操作時(shí)手套引起的交叉污染 （拿過模板 DNA管后應(yīng)更換手套） ⑤ 不明原因引起公用試劑如液體石蠟等污染 （ 必須設(shè)置一個(gè)不含模板 DNA但含 PCR系統(tǒng)中所有其他成分的對(duì)照反應(yīng) 。 這一對(duì)照管須在準(zhǔn)備好所有其他 PCR以后才進(jìn)行吸加 ） 。 ⑥實(shí)驗(yàn)室污染 3. PCR檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定 （ 1） 樣品處理方法不當(dāng) ， 標(biāo)本中雜質(zhì)很多 ， 血清標(biāo)本有蛋白質(zhì) 、 血紅素 、 代謝產(chǎn)物等 。 蛋白質(zhì) —— DNA電泳帶拖尾 血紅素中的卟啉化合物 —— 抑制 Taq酶活性 代謝產(chǎn)物 —— 干擾引物配對(duì) （ 2）操作不當(dāng)帶來的后果 主要指不能嚴(yán)格按照說明進(jìn)行操作造成 PCR檢測(cè)失敗。 如 HCV RNA PCR樣品處理試劑 A、B、 C和 75%乙醇的操作過程。 50μl血清標(biāo)本 ( 標(biāo)本可用血清或血漿 ， 盡量避免使用肝素做抗凝劑 ， 避免反復(fù)凍融 ) 加 200μl試劑 A后立即混勻 ( 試劑 A是強(qiáng)烈的 變性劑 ， 不僅要將病毒外殼變性裂解 ， 釋放 核酸 ， 而且要將樣品中包含的其它蛋白 （ 包括 RNase） 變性 ， 以避免蛋白進(jìn)入 PCR反應(yīng)體系 （ RNase降解 RNA模板 ） ， 干 擾 PCR擴(kuò)增； 混勻 這一步至關(guān)重要 ， 一定要振蕩混合均勻才 能達(dá)到充分變性的結(jié)果 。 ) 加入試劑 B（ 氯仿 、 異戊醇 ） 50μl混勻 （ 抽取變性劑及變性的蛋白 ， 分離出核酸 ， 同樣必須充分 混勻 ， 否則也會(huì)引起 PCR檢測(cè)失敗 ) 14 000r/min離心 5min取上清 80～ 100μl ( 取上清一定要 小心 ， 不能抽取中間蛋白沉淀層 ， 否則 因核酸沉淀中含有變性蛋白 ， 引起 PCR檢測(cè)失敗 ) 加等體積試劑 C14 000r/min離心 10min， 棄上清 (將核酸從水溶液中沉淀濃縮 ) 用 75%乙醇洗一次 (除去與核酸共沉淀的鹽及雜質(zhì) ) 干燥備用 (干燥后 ， 切勿將管子 倒置 或掉落 ， 防止沉淀飛出管底 ) 在痰標(biāo)本處理時(shí)液化是十分重要的 ，痰沒有徹底液化 ， 病原體不能完全釋放出來；反之液化過度會(huì)使病原體裂解 ，導(dǎo)致 PCR檢測(cè)失敗 。 總之， 樣品處理 對(duì) PCR檢測(cè)是至關(guān)重要的，是導(dǎo)致 PCR檢測(cè)失敗的最常見原因之一。
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