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【正文】 PCR A U A U A U UNG A A A 加熱 A A A PCR 該法 優(yōu)點(diǎn) ： ① 去除任河來(lái)源 （ 包括引物在內(nèi) ） 的 污染； ② 由于污染的產(chǎn)物有大量 dU存在 ， 因此 ， UNG處理會(huì)徹底消除污染 。 離心機(jī)： ①離心前，離心管須配平； ②將調(diào)速檔打至 0檔位，才能打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，逐漸升高轉(zhuǎn)速，直至即定轉(zhuǎn)速； ③定時(shí)旋鈕不能強(qiáng)行歸零； ④轉(zhuǎn)頭未停止時(shí)，嚴(yán)禁打開(kāi)蓋板。 常見(jiàn)的原 因有以下 6點(diǎn)： ① 加入試劑或樣品時(shí)引起的交叉污染 （最好在加完所有其他反應(yīng)成分，包括防止蒸發(fā)用的礦物油后才吸加 模板DNA， 將模板加入微量離心管后，蓋好離心管并用戴有手套的手指輕輕單擊管側(cè)壁，以搖勻液體，再作瞬時(shí)離心 [10秒 ]，使水相和有機(jī)相分開(kāi)）。 ) 加入試劑 B（ 氯仿 、 異戊醇 ） 50μl混勻 （ 抽取變性劑及變性的蛋白 ， 分離出核酸 ， 同樣必須充分 混勻 ， 否則也會(huì)引起 PCR檢測(cè)失敗 ) 14 000r/min離心 5min取上清 80～ 100μl ( 取上清一定要 小心 ， 不能抽取中間蛋白沉淀層 ， 否則 因核酸沉淀中含有變性蛋白 ， 引起 PCR檢測(cè)失敗 ) 加等體積試劑 C14 000r/min離心 10min， 棄上清 (將核酸從水溶液中沉淀濃縮 ) 用 75%乙醇洗一次 (除去與核酸共沉淀的鹽及雜質(zhì) ) 干燥備用 (干燥后 ， 切勿將管子 倒置 或掉落 ， 防止沉淀飛出管底 ) 在痰標(biāo)本處理時(shí)液化是十分重要的 ，痰沒(méi)有徹底液化 ， 病原體不能完全釋放出來(lái)；反之液化過(guò)度會(huì)使病原體裂解 ，導(dǎo)致 PCR檢測(cè)失敗 。 如 HCV RNA PCR樣品處理試劑 A、B、 C和 75%乙醇的操作過(guò)程。 (2) 標(biāo)本保存不當(dāng) ， 可引起 PCR失敗 。 PCR熱循環(huán)儀的差異或質(zhì)量問(wèn)題 。 (4) 尿嘧啶 DNA糖基化酶 （ UNG） 法 ： dUTP代替反應(yīng)中的 dTTP， 使產(chǎn)物中含大量 dU， UNG可去除 dU， 使失去dU的位置，阻止 Taq酶的延伸。
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